课题3　分解纤维素的微生物的分离课时教学实录

2.3

分解纤维素的微生物的分离

教学设计

●课标要求

探讨微生物的利用。观察并分离土壤中能分解纤维素的微生物，观察该微生物能否分解其他物质，讨论这类微生物的应用价值。

●课标解读

1．简述纤维素酶的种类及作用。

2．从土壤中分离出分解纤维素的微生物，讨论这类微生物的应用价值。

●教学地位

本课题在学习前面两个课题的基础上，增加了富集培养及鉴别纤维素分解菌这两个步骤，对于前两个课题学习的无菌操作技术、选择培养技术都有应用，因此学习本课题除了复习前面两个课题的相关内容外，还需重点学习鉴别培养基等知识。

●教法指导

1．有关纤维素的内容，可联系必修模块中学习的多糖的知识，该部分内容较简单，可安排学生自学，然后教师利用图解的方式，给出Cx酶、C1酶和葡萄糖苷酶的不同功能，帮助学生记忆。

2．对于富集培养，其原理和上一课题中的选择培养类似，教师可将两个课题中的选择培养对比，进一步引导学生深入认识分离微生物的基本思想。刚果红染色法的原理比较简单，学生通过自学就能够理解。对于两种不同的染色方法，教师应引导学生分析各自的优、缺点，进行比较。

●新课导入建议

利用课题背景进行导入，在全球能源紧缺的情况下，利用纤维素生产酒精具有广阔的应用前景，而且纤维素是地球上含量最为丰富的多糖，将其水解为葡萄糖之后，便可发酵生产酒精。纤维素转化为葡萄糖离不开纤维素酶，获得能产生纤维素酶的微生物就能将纤维素转化为葡萄糖。

一、基础知识

（一）

纤维素与纤维素酶

纤维素与淀粉都是由葡萄糖组成的，但组成两者的葡萄糖的连接方式不同，因而使两者的形态完全不同。

1.

纤维素的分布

纤维素是地球上含量最丰富的多糖类物质.植物的根茎叶等器官都含有大量的维生素.地球上的植物每年产生的纤维素超过70亿吨.棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物。人类以淀粉为主要能量来源，但完全不能消化纤维素，而反刍动物和大量的微生物则主要以纤维素为能量来源。这是因为，在反刍动物的瘤胃中生活着大量的可以分解纤维素的微生物。

2.纤维素酶的组成和作用原理

①纤维素酶(复合酶)的组成：C1酶、Cx酶、葡萄糖苷酶

②纤维素酶的作用原理

C1酶

纤维素

和

Cx酶

3.纤维素酶催化纤维素水解的实验

葡萄糖纤维二糖

（二）纤维素分解菌的筛选

1.刚果红（CR）染色法的原理

当纤维素被分解后，刚果红—纤维素的红色复合物就无法形成，培养基中会形成以纤维素分解菌为中心的透明圈。这样，就可通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。

2.刚果红染色法分离的方法（刚果红染色的具体操作步骤参照课本［资料三］）

方法一：先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应。

方法二：在倒平板时就加入刚果红。

想一想，这两种方法各有哪些优点与不足？你打算选用哪一种方法？

方法一是传统的方法，缺点是操作繁琐，加入刚果红溶液会使菌落之间发生混杂；其优点是这样显示出的颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用。方法二的优点是操作简便，不存在菌落混杂问题，缺点是由于纤维素和琼脂、土豆汁中都含有淀粉类物质，可以使能够产生淀粉酶的微生物出现假阳性反应。但这种只产生淀粉酶的微生物产生的透明圈较为模糊，因为培养基中纤维素占主要地位，因此可以与纤维素酶产生的透明圈相区分。方法二的另一缺点是：有些微生物具有降解色素的能力，它们在长时间培养过程中会降解刚果红形成明显的透明圈，与纤维素分解菌不易区分。

二、实验设计

土壤取样→选择培养→梯度稀释→将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上→挑选产生透明圈的菌落

1.土样采集

土样采集的方法与本专题课题2类似。土样的采集要选择富含纤维素的环境，这是因为在纤维素含量丰富的环境，通常会聚集较多的分解纤维素的微生物。如果找不到合适的环境，可以将滤纸埋在土壤中，过一个月左右也会有能分解纤维素的微生物生长。

为什么要在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌？

由于生物与环境的相互依存关系，在富含纤维素的环境中，纤维素分解菌的含量相对提高，因此从这种土样中获得目的微生物的几率要高于普通环境。

2. 选择培养

（1）目的：增加纤维素分解菌的浓度

为什么选择培养能够“浓缩”所需的微生物？

在选择培养的条件下，可以使那些能够适应这种营养条件的微生物得到迅速繁殖，而那些不适应这种营养条件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到“浓缩”的作用。

（2）

选择培养基的制备。

①从物理性质和用途看此培养基分别属于哪类固体培养基？

液体培养基、选择培养基

②该培养基是如何进行选择的？

该培养基以纤维素为唯一碳源，只有能合成纤维素酶的微生物才能分解利用纤维素。缺乏纤

维素酶的微生物由于不能分解利用纤维素，缺乏碳源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解纤维素的微生物。

③设计对照实验，说明选择培养的作用？

另设一个不含纤维素的普通培养基（如：牛肉膏蛋白胨培养基），其余过程相同。

3）选择培养的操作：

称取土样20 g，在无菌条件下加入装有30 mL培养基的摇瓶中。置于摇床上，在30 ℃下振荡培养1～2 d，至培养基变混浊。

3、梯度稀释：

按照本专题课题1的稀释操作方法，将选择培养后的培养基进行稀释，稀释最大倍数至106。

4、涂布平板：

1）培养基的制备

从物理性质和用途看此培养基分别属于哪类？

固体培养基、鉴别培养基

（2）涂布平板：将稀释度为104～106的菌悬液各取0.1 mL，滴加在平板培养基上，用涂布器将菌液涂布均匀，每个稀释度下需涂布3个平板，并注意设置对照。

（3）在30℃倒置培养，至菌落长出。

5、筛选菌株：

①刚果红染色

②挑选菌落：将产生明显透明圈的菌落，挑取并接种到纤维素分解菌的选择培养基上，在30 ~ 37℃下培养，可获得纯种。

三、课题成果评价

（一）培养基的制作是否合格以及选择培养基是否筛选出菌落：

对照的培养基在培养过程中没有菌落生长则说明培养基制作合格。

如果观察到产生透明圈的菌落，则说明可能获得了分解纤维素的微生物。

（二）分离的结果是否一致：

由于在土壤中细菌的数量远远高于真菌和放线菌的数量，因此最容易分离得到的是细菌。但由于所取土样的环境不同，学生也可能得到真菌和放线菌等不同的分离结果。

四、课题延伸

1、为了确定分离得到的微生物是纤维素分解菌，还需要进行发酵产纤维素酶的实验。纤维素酶的发酵方法有液体发酵和固体发酵。

为什么为确定得到的是纤维素分解菌,还需要进行发酵产纤维素酶的实验

? 确定得到的是纤维素分解菌，只是说明它可以产生纤维素酶！

但是，还要确定一下这种菌产纤维素酶的效率，即产纤维素酶的能力！

不同的纤维素分解菌，对纤维素分解的能力也不一样，要尽量筛选出高产菌株！

2、纤维素酶的测定方法：一般是纤维素酶分解纤维素后产生的葡萄糖进行定量的测定。