课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数优质课教案内容

2.2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

【教学目标】

1.简述尿素在生产实践中的作用及分解尿素的细菌的作用。

2.研究培养基对微生物的选择作用。

3.进行土壤中分解尿素细菌的分离与计数。

4.简述活菌计数技术的应用。

【教学重点难点】

课题重点：对土样的选取和选择培养基的配制

课题难点: 对分解尿素的细菌的计数

【教学过程】

一、筛选菌株

1.实验室微生物的筛选原理

人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、pH等），同时抑制或阻止其他微生物生长。 2.土壤中分解尿素的细菌的分离原理

土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶，这种物质在把尿素分解成无机物的过程中起到催化作用。

①选择培养基的成分：尿素作为唯一的氮源

②鉴定方法：在培养基中加入酚红指示剂，若指示剂变红，pH升高，说明细菌能分解尿素

3.选择培养基

允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称做选择培养基。加入青霉素的培养基：细菌不生长，酵母菌、霉菌等真菌能生长。不加含碳有机物的无碳培养基：分离自养型微生物。

【典型例题】

用来判断选择培养基是否起到了选择作用需要设置的对照是(

) A.未接种的选择培养基

B.未接种的牛肉膏蛋白胨培养基

C.接种了的选择培养基

D.接种了的牛肉膏蛋白胨培养基

【答案】D

【变式训练】

选择培养基是根据某一种或某一类微生物的特殊营养要求或对一些物理、化学抗性而设计的培养基。利用这种培养基可以将所需要的微生物从混杂的微生物中分离出来。为选择酵母菌和硝化细菌，应选用的培养基分别为(

) A.伊红美蓝培养基、含青霉素培养基

B.含青霉素培养基、含氨的无机培养基

C.含氨的无机培养基、含青霉素培养基

D.含青霉素培养基、伊红美蓝培养基

【答案】B【解析】酵母菌是真菌，通常可以用含青霉素的培养基进行选择培养，因为青霉素抑制细菌生长，但不能抑制真菌生长。硝化细菌为自养型生物，能够利用氨转变为亚硝酸和硝酸所释放的能量，把无机物转变为有机物以维持自身生命活动，利用含氨的无机培养基可进行选择培养。

二、统计菌落数目的方法

1.显微镜直接计数法：

①原理：利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量。

②方法：用计数板计数。[来源:学#科#网]

③缺点：不能区分死菌与活菌。

2.间接计数法(活菌计数法)：

①原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。

②计算公式：每克样品中的菌株数＝(C÷V)×M，其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)，M代表稀释倍数。

③操作：设置重复组，增强实验的说服力与准确性。同时为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数。

【典型例题】

用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数，在对应稀释倍数为10的培养基中，得到以下几种统计结果，正确的是

(

) 6A．涂布了一个平板，统计的菌落数是230 B．涂布了两个平板，统计的菌落数是215和260，取平均值238 C．涂布了三个平板，统计的菌落数分别是21、212和256，取平均值163 D．涂布了三个平板，统计的菌落数分别是210、240和250，取平均值233

【答案】D 【变式训练】

某同学在稀释倍数为10的培养基上测得平板上的菌落数的平均值为234，那么每毫升样品中菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1 mL）（ ）

A.2.34×10

B.2.34×10【答案】B 【解析】稀释倍数为10，0.1 mL稀释液的菌落数的平均值为234，则每毫升样品中菌落数就为234/0.1×10=2.34×10。

三、实验设计

1.土壤取样

从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。 2.制备培养基 牛肉膏蛋白胨培养基作为对照，判断选择培养基是否起到选择作用。 3.样品稀释、取样涂布

因为土壤中各类微生物的数量是不同的，为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。 注意：由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此选择了一个较为宽泛的范围：稀释倍数为10～10。

4.微生物的培养、观察并记录结果

将涂布好的培养皿放在30℃下培养。比较牛肉膏培养基和选择培养基中菌落的数量、形态等，并做好记录。 不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间

5.细菌的计数 当菌落数目稳定时，选取菌落数在30~300的平板进行计数。在同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。 【典型例题】

下列有关“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数实验”的叙述，正确的是（

）A. 分解尿素的细菌能产生脲酶，将尿素分解产生氮气来源学科网][来源学科网来源学*科*网689 C.234

D.23.4 66937

B. 将实验组和对照组平板倒置，25℃恒温培养24～48小时

C. 统计尿素分解菌的数目时，以菌落数在300以上的平板进行计数

D. 用尿素为唯一氮源、加有酚红指示剂的培养基培养尿素分解菌，指示剂变红

【答案】D 【变式训练】

下列关于“检测土壤中细菌总数”实验操作的叙述中，不正确的是(

) A.用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基，经高压蒸汽灭菌后倒平板

B.取104、105、106倍的土壤稀释液和无菌水各0.1 mL涂布到不同平板上培养

C.将实验组和对照组平板倒置，37 ℃恒温培养24～48小时

D.确定对照组无菌后，选择菌落数在300以上的平板进行计数

【答案】D