课题3　血红蛋白的提取和分离优秀获奖教案

专题5课题3 血红蛋白的提取和分离

主备人：邓海群 审核人：高三生物教研组

班别： 座号： 姓名： 【学习目标】:1.尝试从血液中提取和分离血红蛋白

2.了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理

【学习重点】:凝胶色谱法的原理和方法

【学习难点】:样品的预处理；色谱柱填料的处理和色谱柱的装填

1．基础知识

蛋白质的物化理性质： 等千差万别，由此提取和分离各种蛋白质。

1．1凝胶色谱法（分配色谱法）：

（1）原理：（图5－13a） 的分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程 ，流动 ；

的分子穿过多孔凝胶颗粒内部，路程 ，流动 。

（2）凝胶材料： （3）分离过程：（图5－13b）

混合物上柱→ → 分子流动快、 分子流动慢→收集 分子→收集 分子

【补充】洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。

1．2缓冲溶液

（1）原理：由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成（如H2CO3－NaHCO3，HC－NaC，NaH2PO4/Na2HPO4等），调节 。

（2）缓冲液作用： 1．3凝胶电泳法：

（1）原理：不同蛋白质的 不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。

［思考］阅读教材后，填写下表：

电荷性质

电荷量

分子形状

分子大小

决定运动方向

√

形成库仑力

√

形成阻力

√

√

决定运动速率

√

√

√

（2）分离方法： 。

（3）分离过程：在一定pH下，使蛋白质基团带上正电或负电；加入带负电荷多的 ，形成“蛋白质－SDS复合物”，使蛋白质迁移速率仅取决于 。

2．实验设计

2.1蛋白质的提取和分离一般分为哪些基本步骤？

【思考】：是否所有种类的蛋白质的提取和分离都是这样的？为什么？

2.2选择实验材料

- 1 -

（1）你认为鸟类血液和哺乳动物血液中，最好哪种血液来提取血红蛋白？为什么？

（2）请阅读教材，认识哺乳动物血液组成及血红蛋白性质。并思考回答下列问题：

血液由 和 两部分组成。

血细胞中 细胞数量最多，细胞的含量中，除水以外，最高的化合物是 。

该化合物是由 和 构成的，其中每个亚基中都含有一个能与O2和CO2结合的 基团。

2.3样品处理：洗涤红细胞、释放血红蛋白、分离血红蛋白

(1)红细胞的洗涤过程

离心→吸出上清液→反复洗涤直至上清液无 色

【思考1】：加入柠檬酸钠有何目的？为什么要低速、短时离心？为什么要缓慢搅拌？

【思考2】：分离红细胞离心速度不能过高和时间过长的原因是 。洗涤红细胞的目的是 。用生理盐水洗涤红细胞的原因是 。洗涤次数不能过少的原因是 。洗涤成功的标志是 。

（2）释放血红蛋白

在红细胞液中加入蒸馏水的目的是 ，甲苯的作用是 ，充分搅拌的目的是 。

（3）分离血红蛋白

将血红蛋白从混合液中分离出来所使用的方法是 。右图是分离结果示意图，图中①②③④的物理性质分别是 ，主要成分分别是 。将血红蛋白从中分离出来要经过 过滤和 分离两步。

2.4粗分离：透析

（1）如何除无机盐离子和小分子有机物质呢？ 半透膜的 ，大分子物质不能通过半透膜，离子和小分子能够通过半透膜。

思考：为何使用pH＝7的磷酸缓冲液？为什么缓冲液量远多于血红蛋白溶液量？

（2）右图装置用于 ，其目的是 。若B是血红蛋白溶液，则A是 。

2.5纯化

凝胶色谱分离蛋白质包括：制作 、装填 、 和 。

（1）根据教材图5－19，说出制作色谱柱需要的材料。 （2）色谱柱的制作过程：准备材料→加工橡皮塞→安装色谱柱

以下是凝胶色谱柱的制作过程图解，正确的顺序是 透析袋

A B 血液＋ → 短时离心→吸出上层血浆→红细胞＋5倍体积生理盐水

→缓慢搅10min→ - 2 -

打a b c d e f 安装玻璃管

挖出凹穴

（3）凝胶色谱柱的装填。请阅读教材：色谱柱的装填过程。

步骤

①

②

③

④

⑤

操作要求

计算称量凝胶

配制悬浮液

装填悬浮液

缓冲液洗涤平衡

操作要求

色谱柱 在支架上

根据色谱柱体积计算凝胶用量

凝胶颗粒＋蒸馏水→充分溶胀

凝胶颗粒＋洗脱液→沸水浴

倒入； 立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡 h SephadexG-75 a 上右图是装填的凝胶色谱柱，据图分析：

①图中“G”表示 ，75表示 。加入前需放在洗脱液中膨胀，为了加速膨胀，可用沸水浴加热，这样不但可以节约时间，而且可以 。

②装填凝胶时要先打开[a ] ，然后一次性倒入并轻轻敲动色谱柱，目的是 。装填过程中若发现有气泡存在，必须重装，因为气泡会 ，降低分离效果。

③装填完后，为了使凝胶装填紧密，还需使用 充分洗涤平衡凝胶12h。该过程中出现何种现象需要重新装填凝胶色谱柱？ 。

（4）样品加入和洗脱。其基本过程是：

调节缓冲液面→加入蛋白质样品→调节缓冲液面→洗脱→收集分装蛋白质

下图A是样品的加入示意图，图B是洗脱示意图。

品

样品

样e 压操作

a b c A d

B ①加样前需先让凝胶面上的缓冲液下降至与凝胶面平齐，操作方法是 。加样时正确的操作次序是 。

②洗脱液e是 ，洗脱时要打开 ，待 接近色谱柱底端时，用试管收集流出液。

③如何确定色谱柱的制作是成功的？ 。

2.6纯度鉴定

在鉴定的方法中，最多使用的是 - 3 -

3.操作提示

（1）红细胞的洗涤：

（2）凝胶的预处理：

（3）色谱柱的装填：

（4）色谱柱成功标志：

4.习题巩固

4.1凝胶色谱法和凝胶电泳法是分离蛋白质的两种常用方法，据此回答问题。

（1）凝胶色谱法分离蛋白质的原理是根据不同大小的蛋白质分子在凝胶柱中的 不同而实现分离的：

（2）使用电泳法分离蛋白质．是利用了待分离样品中各种分子的 差异，以及分子本身的 、形状的不同。

4.2凝胶色谱法是一种快速而又简单的分离技术，请据图回答相关问题：

（1）a、b均为蛋白质分子，其中先从层析柱中洗脱出来的是 ，原因是 ○··a ○（2）自己制作凝胶色谱柱时，在色谱柱底部d位置相当于多孔板的结构可由 ·

替代。

○·○

b

○

··

（3）凝胶色谱柱的直径大小会影响分离的效果吗? 。图中a和b的分离度

○

与凝胶色谱柱的高度有吗? 。

c ○

（4）在哪些情况下需要重装凝胶色谱柱？ 。

（5）洗脱用的液体应尽量与浸泡凝胶所用的液体

(填“相同”d

或“不同”)，洗脱时，对洗脱液的流速要求是

。

（6）对样品进行粗分离的方法是 ，纯化的方法是 。判断纯化的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质纯化的鉴定。在鉴定的方法中使用最多的是 凝胶电泳。

4.3

请回答有关蛋白质分离和纯化的问题: (1) 要获得血清蛋白的粗制品,必须将含有柠檬酸钠的血液进行

处理,然后将

装入透析袋中除去

。

(2) 要获得血红蛋白,应如何破碎红细胞?

。

(3) 下图为血清蛋白通过醋酸纤维薄膜的电泳图谱,你认为含量最多的蛋白质是

,含负电荷最多的球蛋白是

,相对分子质量最大的球蛋白是

。

(4) 电泳是目前应用最为普遍的

蛋白质的方法。

- 4 -