课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数教案评析

土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

1.实验室中微生物筛选的原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)同时抑制或阻止其他微生物的生长。

2．在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称做选择培养基。

3．测定微生物数量的常用方法有活菌计数法和显微镜直接计数法。稀释涂布平板法常用来统计活菌的数目，但统计结果往往比活菌的实际数目低。

4．只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，因此可用尿素作为唯一氮源的选择培养基分离能分解尿素的细菌。

5．鉴定分解尿素细菌的方法是在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，依据是否变红进行判断。

阅读教材，基础知识填空

一、研究思路

1．筛选菌株

(1)实验室中微生物筛选的原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物的生长。

(2)选择培养基：在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称做选择培养基。

2．统计菌落数目

(1)活菌计数法：常用稀释涂布平板法。

①原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。

②计算公式：每克样品中的菌株数＝(C÷V)×M。

C：代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数。

V：代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)。

M：代表稀释倍数。

③统计方法：为了保证结果准确，一般设置3～5个平板，选择菌落数在30～300的平板进行计数，并取其平均值。

(2)显微镜直接计数法：在显微镜下直接观察和计数微生物的数量。

3．设置对照

(1)对照实验：指除了被测试的条件外，其他条件都相同的实验。

(2)主要目的：排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。

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二、实验设计

1．土壤取样

从富含有机质、酸碱度接近中性且潮湿的土壤取样。先铲去表层土，在距地表约3～8 cm的土壤层取样。

2．样品的稀释

(1)稀释原因：样品的稀释度直接影响平板上生长的菌落数目。

(2)稀释标准：选用一定稀释范围的样品液进行培养，保证获得菌落数在 30～300之间，便于计数。

3．微生物的培养与观察

(1)培养：不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。

(2)观察：每隔 24_h统计一次菌落数目，最后选取菌落数目稳定时的记录作为结果。

三、操作提示

1．无菌操作

(1)取土样的用具在使用前都需要灭菌。

(2)应在酒精灯火焰旁称取土壤，并在酒精灯火焰附近将称好的土样倒入锥形瓶中，塞好棉塞。

(3)在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在酒精灯火焰旁操作。

2．做好标记：本实验使用的平板和试管比较多。为避免混淆，最好在使用前就做好标记。

3．制定计划：对于耗时较长的生物实验，要事先规划时间，以便提高工作效率。

四、菌种鉴定

1．原理：分解尿素的细菌合成的脲酶将尿素分解为氨，使培养基的碱性增强。

2．方法：在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌，若指示剂变红，可初步鉴定该种细菌能够分解尿素。

基础知识自测

1．在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基称做(

) A．鉴别培养基

B．加富培养基

C．选择培养基 D．基础培养基

解析：选C 选择培养基是在培养基中加入特殊营养物质或化学物质，抑制不需要微生物的生长，有利于所需微生物生长的培养基。

2．用稀释涂布平板法来统计样品中活菌的数目。在某稀释度下一同学做了若干个平板并统计每个平板的菌落数，最接近样品中菌株数真实值的是(

) A．菌落数目最多的平板

B．菌落数目最少的平板

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C．菌落数目适中的平板

D．取若干个平板上菌落数目的平均值

解析：选D 用稀释涂布平板法对样品中活菌数目进行统计，只是一种估测，根据此方法的实验过程可知，在某一稀释度下涂布的平板菌落数具有一定的偶然性，并不是绝对均匀，所以取若干个平板上菌落数目的平均值比较接近样品中菌株数的真实值。

3．用稀释涂布平板法来统计样品中活菌的数目，其结果与实际值相比(

) A．比实际值高 B．比实际值低

C．和实际值一致 D．比实际值可能高也可能低

解析：选B 培养基上的一个菌落也可能由相连的两个或多个菌体繁殖而来，并且该方法测得的是活菌的菌落数目，未包括死细菌数，因此统计的活菌数要少于菌体实际值。

4．产生每个标准菌落的细菌的最初数目和培养基分别是(

) A．一个细菌，液体培养基

B．许多细菌，液体培养基

C．一个细菌，固体培养基

D．许多细菌，固体培养基

解析：选C 在微生物的培养中产生每个标准菌落的细菌的最初数目是一个细菌，使用的培养基为固体培养基。

5．用以尿素为唯一氮源加入酚红指示剂的培养基，培养尿素分解菌后，指示剂将(

) A．变蓝色 B．变红色

C．变黑色 D．变棕色

解析：选B 尿素分解菌合成的脲酶将尿素分解成了氨，会使培养基的碱性增强，pH升高，加入酚红指示剂将变红。

课堂教学设计：强调难点、突破重点

核心要点一1．筛选菌株的原理

(1)原理：根据不同微生物的特殊营养要求或其对某化学、物理因素的抗性不同而制备培养基。

(2)方法：

①在培养基中加入某种化学物质。例如，加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌；加入高浓度的食盐可以得到金黄色葡萄球菌。

②改变培养基中的营养成分。例如，缺乏氮源时可以分离固氮微生物；石油作为唯一碳源时，可以分离出能消除石油污染的微生物；用含无机碳源的培养基分离自养型微生物。

- 3 - | 筛选菌株的原理及统计菌落数目的方法

③改变微生物的培养条件。例如，将培养基放在高温环境中培养可以得到耐高温的微生物；用普通培养基在无氧条件下分离厌氧型和兼性厌氧型微生物。

[名师点拨] 选择培养基上生长的微生物≠目的菌

原则上选择培养基只能允许特定种类的微生物生长，但实际上，微生物的培养是一个非常复杂的问题，有些微生物可以利用其他微生物的代谢产物生长繁殖，因此能在选择培养基上生长的微生物不一定都是所需的微生物，还需进一步鉴定。

2．统计菌落数目的方法

微生物生长量的测定有计数法、重量法、生理指标法等方法，但是一般使用计数法，计数法可分为直接计数法和间接计数法。二者的比较如下表所示：

项目

直接计数法

间接计数法

当样品的稀释度足够高时，培养基利用特定细菌计数板或血细胞计原理

数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量

表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌

主要用具

计数数据

优点

缺点

显微镜、细菌计数板

菌体本身

计数方便、操作简单

死菌、活菌都计算在内

每毫升原液含菌数＝每小格平均菌体数×400×10 000×稀释倍数

培养基

培养基上菌落数

计数的是活菌

操作较复杂，有一定误差

每毫升原液含菌数＝培养基上平均菌落数×稀释倍数÷涂布液体积

计算公式

[题组冲关] 1．(全国卷Ⅰ)某些土壤细菌可将尿素分解成CO2和NH3，供植物吸收和利用。回答下列问题：

(1)有些细菌能分解尿素，有些细菌则不能，原因是前者能产生__________。能分解尿素的细菌不能以尿素的分解产物CO2作为碳源，原因是__________________________。但可用葡萄糖作为碳源，进入细菌体内的葡萄糖的主要作用是__________________(答出两点即可)。

(2)为了筛选可分解尿素的细菌，在配制培养基时，应选择________(填“尿素”“NH4NO3”或“尿素＋NH4NO3”)作为氮源，不选择其他两组的原因是____________________________________________________。

(3)用来筛选分解尿素细菌的培养基含有KH2PO4和Na2HPO4，其作用有________________________________________________(答出两点即可)。

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解析：(1)土壤中的某些细菌之所以能够分解尿素，是因为它们能产生脲酶。尿素分解菌是异养生物，不能利用CO2来合成有机物，必须利用现成的有机物(如葡萄糖)作为碳源；葡萄糖通过呼吸作用被分解时，能为细胞生命活动提供能量，同时，葡萄糖还可以转化成脂肪、某些氨基酸等物质，所以进入细菌体内的葡萄糖能为其他有机物的合成提供原料。(2)选择培养基只是允许特定种类的微生物(目的微生物)生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。本实验的目的菌是可分解尿素的细菌，因此配制的培养基应只允许尿素分解菌生长，NH4NO3可以作为所有细菌的氮源，培养基中如含有NH4NO3，将不能起到筛选作用。(3)KH2PO4和Na2HPO4能为细菌生长提供钾盐、钠盐和磷酸盐，而H2PO4/HPO4可作为缓冲剂，使培养基中pH保持相对稳定。

答案：(1)脲酶

分解尿素的细菌是异养生物，不能利用CO2来合成有机物

为细胞生命活动提供能量，为其他有机物的合成提供原料

(2)尿素

其他两组都含有NH4NO3，能分解尿素的细菌和不能分解尿素的细菌都能利用NH4NO3，不能起到筛选作用

(3)为细菌生长提供无机营养，作为缓冲剂保持细胞生长过程中pH稳定

2．自然界中的微生物往往是混杂生长的。人们在研究微生物时一般要将它们分离提纯，然后进行数量的测定。下面是对大肠杆菌进行数量测定的实验，请回答有关问题：步骤如下：

①制备稀释倍数为10、10、10、10、10的系列稀释液。

②为了得到更加准确的结果，应选用________________法接种样品。

③适宜温度下培养。

结果分析：

(1)测定大肠杆菌数时，在对应稀释倍数为10的培养基中，得到以下几种统计结果，与事实更加接近的是____________________________________。

A．涂布了1个平板，统计的菌落数为230 B．涂布了2个平板，统计的菌落数是215和260，取平均值238 C．涂布了3个平板，统计的菌落数分别是21、212和256，取平均值163 D．涂布了3个平板，统计的菌落数分别是210、240和256，取平均值235 (2)一同学在稀释倍数为10的培养基上测得平板上菌落数的平均值为212，那么每毫升样品中的菌落数约是(涂布平板时所用的稀释液体积为0.2 mL)_________________ _____。

(3)用这种方法测定的细菌数量要比实际活菌数量________(填“多”或“少”)，因为___________________________________________。

解析：若对大肠杆菌进行计数，则需要用稀释涂布平板法接种样品。(1)应选取多个菌落数相差不大的平板计数，取其平均值。(2)212÷0.2×10＝1.06×10(个)。(3)因为菌落可能由1个或多个细菌连在一起繁殖而成，所以实际活菌数量要比测得的数量多。

答案：步骤②：稀释涂布平板

(1)D (2)1.06×10个

(3)少

当两个或多个细菌连在一起时，平板上观察到的是一个菌落

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核心要点二1．实验流程

| 实验设计及操作

稀释度

1 菌落数/平板

菌数/克土壤

2．实验设计原则

(1)设立重复组：统计某一稀释度下平板上的菌落数时，要至少涂布3个平板作重复组，以增强实验结果的说服力与准确性。

(2)设立两种对照组：

①判断培养基中是否有杂菌污染，需同时将未接种的选择培养基进行培养。

②判断选择培养基是否具有筛选作用，需同时设立牛肉膏蛋白胨培养基进行接种后培养，观察两种培养基上的菌落数目，进行对比得出结论。

2

10

3

平均值

1

2

410

3

平均值

1

2

510

3

平均值

6

- 6 -

3．结果分析与评价

内容

有无杂菌污染

的判断

选择培养基的筛选作用

样品的稀释操作

重复组的结果

现象

对照的培养皿中无菌落生长

培养基中菌落数偏高

菌落形态多样，菌落数偏高

牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目大于选择培养基上的数目

得到2个或2个以上菌落数目在30～300的平板

结论

未被杂菌污染

被杂菌污染

培养基中混入其他氮源

选择培养基具有筛选作用

操作成功

若选取同一种土样，统计结果应接近

[题组冲关] 3．下列有关土壤中微生物的分离与计数的说法，错误的是(

) A．因为土壤中各类微生物的数量不同，所以为获得不同类型的微生物要按不同的稀释倍数进行分离

B．测定土壤中不同微生物的数量，选用的稀释范围不同

C．如果得到了2个或2个以上菌落数目在30～300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数

D．牛肉膏蛋白胨培养基的菌落数目明显小于选择培养基的数目，说明选择培养基已筛选出一些细菌菌落

解析：选D 样品的稀释度直接影响平板上生长的菌落数目。实际操作中，通常选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得菌落在30～300之间适于计数的平板。土壤中不同类型的微生物的数量不同，因此在测定其数量时，选用的稀释范围也不同。将菌液稀释相同的倍数，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，从而说明选择培养基的筛选作用。

4．如图表示研究者从土壤中筛选分解尿素的细菌并计数的相关实验，请据图回答下列问题：

(1)进行过程①和②的目的分别是________________和______________________；图中弧线箭头上“？”的具体操作是____________。

(2)进行培养基配制和灭菌时，灭菌与调节pH的先后顺序是____________________。倒平板时，待平板冷却凝固后，应将平板倒过来放置，并用记号笔在皿底上标明培养微生物的

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名称、平板上培养样品的稀释度、制作者姓名、培养日期及____________________等信息。纯化菌种时为了得到单一菌落，常采用的接种方法是__________________和________________。

(3)在以尿素为唯一氮源的培养基中加入____________。培养后，若出现____________色就可以鉴定其中含有能够分解尿素的细菌。 (4)研究者可以通过观察培养形成的菌落的________________________、隆起程度等特征，来判断培养基上是否感染了其他细菌。在实验中，研究者每隔24小时统计一次菌落数目，并选取菌落数目稳定时的记录作为结果，这样可以防止________________________________________。

解析：从土壤中分离尿素分解菌的一般步骤是土壤取样、选择培养、梯度稀释、涂布培养和筛选菌株。图中①过程是选择培养，②过程为梯度稀释，③过程是稀释涂布平板法接种培养。(1)结合分析可知，进行过程①和②的目的分别是选择培养和增加分解尿素的细菌的数量。图中弧线箭头上“？”的具体操作是挑出菌落。(2)进行培养基配制和灭菌时，为了减少培养过程被杂菌感染的机会，应先调节pH后灭菌。倒平板时，待平板冷却凝固后，应将平板倒过来放置，并用记号笔在皿底上表明培养微生物的名称、平板上培养样品的稀释度、制作者姓名、培养日期及培养基种类等信息。纯化菌种时为了得到单一菌落，常采用的接种方法是平板划线法和稀释涂布平板法。(3)根据尿素分解菌将尿素分解后产生碱性物质氨，氨与酚红指示剂相遇变红的原理，需要在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养后，若出现红色就可以鉴定其中含有能够分解尿素的细菌。(4)根据不同细菌形成的菌落特征不同，研究者可以通过观察培养形成的菌落的形状、大小、颜色、隆起程度等特征，来判断培养基上是否感染了其他细菌。研究者每隔24小时统计一次菌落数目，并选取菌落数目稳定时的记录作为结果，这样可以防止因培养时间不足导致遗漏细菌数目。

答案：(1)选择培养

增加分解尿素的细菌的数量

挑出菌落

(2)先调节pH后灭菌

培养基种类

平板划线法

稀释涂布平板法

(3)酚红指示剂

红

(4)形状、大小、颜色

因培养时间不足导致遗漏细菌数目

拓展练习：巩固基础、提升能力

[随堂基础巩固] 1．下列关于土壤取样的叙述，错误的是(

) A．土壤取样时，应选取肥沃、湿润的土壤

B．先铲去表层土3 cm左右，再取样

C．取样用的小铁铲和信封在使用前不用灭菌

D．应在酒精灯火焰旁称取土壤

解析：选C 在“分解尿素的细菌的分离与计数”实验中，必须在含微生物丰富的湿润、

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肥沃土壤中取样，所用小铁铲和信封必须灭菌。

2．测定土壤中细菌的数量一般选10、10和10倍的稀释液进行平板培养，而测定真菌的数量一般选用10、10和10倍稀释液，其原因是(

) A．细菌个体小，真菌个体大

B．细菌易稀释，真菌不易稀释

C．细菌在土壤中的含量比真菌高

D．随机的，没有原因

解析：选C 细菌在土壤中的含量多于真菌，因此稀释涂布时，细菌的稀释倍数要大于真菌的稀释倍数，这样才能使平板上培养出的菌落清晰易辨。

3．下列属于菌落特征的是(

) ①菌落的形状

②菌落的大小

③菌落的多少

④隆起程度

⑤颜色

⑥有无荚膜

A．①②③④

B．①②④⑤

C．②③④⑥ D．①②③④⑤⑥

解析：选B 菌落特征包括菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等。

4．下列能分离出分解尿素的细菌的培养基是(

) A．KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、葡萄糖、尿素、琼脂、水

B．KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、葡萄糖、琼脂、水

C．KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、尿素、琼脂、水

D．KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、牛肉膏、蛋白胨、琼脂、水

解析：选A 要想分离尿素分解菌，应把尿素作为培养基中的唯一氮源，而B项中无氮源，C项中无碳源，D项中牛肉膏、蛋白胨都可作为氮源。

5．用来判断选择培养基是否起到了选择作用，需要设置的对照是(

) A．未接种的选择培养基

B．未接种的牛肉膏蛋白胨培养基

C．接种了的牛肉膏蛋白胨培养基

D．接种了的选择培养基

解析：选C 将菌液稀释相同的倍数并接种，牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目应明显多于选择培养基上的菌落数目，因此，应选择接种菌种的牛肉膏蛋白胨培养基作为对照。对照实验遵循的原则是单一变量原则。

6．某同学对10、10、10倍稀释液计数的平均菌落数分别为2 760、295和16，则菌落总数为(所用稀释液体积为0.1 mL)(

) A．2.76×10个/mL B．2.95×10个/mL C．4.6×10个/mL D．3.755×10个/mL 解析：选B 菌落计数法是计算不同稀释度的平均菌落数。首先选择平均菌落数在30～

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300之间的平板，以该平均菌落数与体积之比乘以稀释倍数即为该样品的细菌总数。若所有稀释倍数的菌落数均不在30～300之间，则应以最接近300或30的平均菌落数进行计算。

7．尿素是一种重要的农业氮肥，不能直接被农作物吸收，只有当土壤中的微生物将尿素分解后才能被植物吸收利用。因此，对土壤中分解尿素的微生物进行分离和鉴定具有重要意义。回答下列问题：

(1)对土壤中分解尿素的微生物的分离过程如下：

第一步：土壤取样。取土样用的工具和盛土样的信封等在使用前都需要________(填“消毒”或“灭菌”)。

第二步：样品稀释。通常分离不同种类的微生物要采用不同的稀释度，原因是________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。

第三步：微生物的培养与观察。将一定稀释度的样品接种在以尿素为唯一氮源的培养基上，并在适宜的条件下培养。分解尿素的微生物能在该培养基上生长繁殖，而____________________________________则不能生长繁殖。

(2)若对土壤悬液进行梯度稀释时，未经振荡而直接取上层悬液进行梯度稀释，用稀释倍数为10的样液涂布到平板上进行培养和计数，统计出的菌落数往往比正确操作统计出的菌落数____________。

(3)若要对上述初步筛选出的分解尿素的微生物作进一步的鉴定，需在如表所示培养基配方中添加的物质是________、________。若分离得到的是尿素分解菌，则培养基中pH升高使酚红指示剂变为红色，pH升高的原因是____________________________________。

成分

培养基

(含量) KH2PO4

Na2HPO4

MgSO4·

7H2O 0.2 g 酚红

指示剂

0.01 g 尿素

蒸馏水

41.4 g 2.1 g 1.0 g 1 000 mL 解析：(1)取土样用的工具和盛土样的信封等在使用前都需要灭菌。由于土壤中不同生物的数量不同，因此分离不同种类的微生物要采用不同的稀释度。将一定稀释度的样品接种在以尿素为唯一氮源的培养基上，并在适宜的条件下培养，分解尿素的微生物能在该培养基上生长繁殖，不能利用尿素的微生物则不能生长繁殖。(2)若对土壤悬液进行梯度稀释时，未经振荡而直接取上层悬液进行梯度稀释。由于此种细菌属于需氧型细菌，主要分布在上层培养液，因此用稀释倍数为10的样液涂布到平板上进行培养和计数，统计出的菌落数往往比正确操作统计出的菌落数偏高。(3)培养基的成分应包括碳源、氮源、水和无机盐等。若要对上述初步筛选出的分解尿素的微生物作进一步的鉴定，需在表中培养基配方中添加的物质是葡萄糖(作为碳源)、琼脂(固体培养基中的凝固剂)。若分离得到的是尿素分解菌，则尿素分解菌合成的脲酶将尿素分解成氨，使培养基中的pH升高，酚红指示剂变为红色。

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答案：(1)灭菌

土壤中各类微生物的数量不同

不能利用尿素的微生物

(2)偏高

(3)葡萄糖

琼脂

尿素分解菌合成的脲酶将尿素分解成氨

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