课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数评课稿

课题2

土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

一、研究思路

1．筛选菌株

(1)原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物的生长。

(2)选择培养基：允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。

2．统计菌落数目

(1)常用方法：稀释涂布平板法。当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。

(2)测定微生物数量的常用方法还有显微镜直接计数法。

3．设置对照：排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。

二、实验设计

土壤取样→样品的稀释→微生物的培养与观察

1．土壤取样一般要铲去表层土，因为绝大多数细菌分布于距地表约

3～8_cm的土壤层。

2．样品的稀释：不同的微生物需要稀释的倍数不同。(填表) 微生物

稀释倍数

细菌

104、105、106

放线菌

103、104、105

真菌

102、103、104

3.微生物的培养与观察

(1)培养：不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。

(2)观察：每隔24_h统计一次菌落数目，最后选取菌落数目稳定时的记录作为结果。

三、操作提示

1．无菌操作：取土样用的小铁铲和盛土样的信封都要进行灭菌；称取土样要在火焰旁进行，稀释样品要在火焰旁操作。

2．做标记：对平板和试管进行标记，尤其进行系列稀释时要按照稀释度递增的顺序将试管排列成行。

3．制定计划：对于耗时较长的生物实验，要事先规划时间，以便提高工作效率。

四、菌种鉴定

1．原理：分解尿素的细菌合成的脲酶将尿素分解成氨，使培养基的碱性增强。

2．方法：在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂培养细菌，若指示剂变红，可确定该种细菌能够分解尿素。

1．尿素能被尿素分解菌分解的原因是什么？

2．筛选菌落和统计菌落数目的方法及对照实验的设计方法是什么？

3．如何利用选择培养基分离细菌？

4．样品如何进行稀释？如何测定分解尿素的细菌数量？

5．脲酶的检测方法是什么？

探究点一

[共研探究]

1．筛选菌株

分析下表所示培养基的配方，回答下列问题：

成分

KH2PO4

Na2HPO4

MgSO4·7H2O 含量

1.4 g 2.1 g 0.2 g 成分

葡萄糖

尿素

琼脂

含量

10.0 g 1.0 g 15.0 g 筛选微生物的研究思路

将上述物质溶解后，用自来水定容到1 000 mL (1)在该培养基的配方中，为微生物提供碳源的物质是葡萄糖，提供氮源的物质是尿素。

(2)该培养基是否具有选择作用，为什么？

提示：是。绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，本培养基以尿素为唯一氮源，可以分离得到产生脲酶的微生物(即分解尿素的微生物)。

2．统计菌落数目

(1)为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数。

(2)要设置对照实验，且一定要涂布至少3个平板作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性。

(3)用此种方法统计的菌落数目往往比活菌的实际数目低。这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此，统计结果一般用菌落数而不是用活菌数来表示。

(4)活菌数的计算方法(公式)：每克样品中的菌株数＝(C÷V)×M。C表示某一稀释度下平板上生长的平均菌落数；V表示涂布平板时所用的稀释液的体积；M表示稀释倍数。

3．设置对照

教材P22～23提供的案例中A同学的结果与其他同学不同，可能的解释有两种。一是由于土样不同，二是由于培养基污染或操作失误。如何设置对照实验来确定原因？

提示：方案一：其他同学用与A同学一样的土样进行实验，如果结果与A同学一致，则证明A同学操作无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。

方案二：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。

[总结升华]

1．微生物的筛选

(1)选择培养微生物的两种方法

①可利用该分离对象对某种营养物质有“嗜好”的原理，专门在培养基中加入该营养物质，并且使该营养物质成为培养基中某类基本营养物质的唯一供给者。如筛选能分解尿素的细菌，就可将尿素作为培养基中的唯一氮源。

②可利用该分离对象对某种抑菌物质的抗性，在混合培养物中加入该抑菌物质，经培养后，其他微生物生长受到抑制，而该分离对象却可乘机大量增殖，在数量上占据优势。

(2)常见的选择培养基

①将培养基放在高温环境中培养，分离耐高温的微生物。

②以石油为唯一碳源的培养基，可以分离能消除石油污染的微生物。

③不含有机碳源的培养基可以分离自养型微生物。

④无氮源培养基可以分离固氮微生物。

⑤加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌。

⑥加入高浓度的食盐可得到金黄色葡萄球菌。

2．统计菌落数目的方法

微生物生长量的测定有计数法、重量法、生理指标法等方法，但是一般使用计数法，计数法可分为直接计数法和间接计数法。二者的比较如表所示：

项目

直接计数法

间接计数法

当样品的稀释度足够高时，培养基表利用特定血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量

面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌

主要用具

计数依据

优点

缺点

计算公式

显微镜、血细胞计数板

菌体本身

计数方便、操作简单

死菌、活菌都计算在内

每毫升原液含菌数＝400×104×每小格平均菌体数×稀释倍数

①原理

培养基

培养基上菌落数

计数的是活菌

操作较复杂，有一定误差

每毫升原液含菌数＝培养基上平均菌落数÷涂布液体积×稀释倍数

注：①400、104是常数。

3．实验设计原则

(1)单一变量原则。对照实验中除测试因素(自变量)不同外，其他因素要保证和实验组相同。

(2)平行重复原则。任一稀释度至少涂布3个平板，以增强实验结果的可信度与准确性。

(3)对照原则。

①判断培养基是否有杂菌污染，需要将未接种的相同培养基在相同条件下同时进行培养。

②判断培养基是否起到了筛选的作用，需要同时设立牛肉膏蛋白胨培养基进行同样接种后培养，观察两种培养基上的菌落数目是否有显著差异。

[对点演练]

1．下列关于统计菌落数目方法的叙述，错误的是(

) A．当样品的稀释度足够高时，一个活菌会形成一个菌落

B．为了保证结果准确，一般采用菌落密度较大的平板进行计数

C．采用稀释涂布平板法计数获得的菌落数往往少于实际的活菌数

D．在某一浓度下涂布三个平板，若三个平板统计的菌落数差别不大，则应以它们的平均值作为统计结果

解析：选B

当样品的稀释度足够高时，一个活菌会形成一个菌落；为了保证结果准确，一般选取菌落数在30～300之间的平板进行计数；采用稀释涂布平板法计数获得的菌

落有可能是由多个细菌形成的，所以往往少于实际的活菌数；在某一浓度下涂布三个平板，若三个平板统计的菌落数差别不大，则应以它们的平均值作为统计结果以减小实验误差。

2．(2017·全国卷Ⅰ)某些土壤细菌可将尿素分解成CO2和NH3，供植物吸收和利用。回答下列问题：

(1)有些细菌能分解尿素，有些细菌则不能，原因是前者能产生__________。能分解尿素的细菌不能以尿素的分解产物CO2作为碳源，原因是__________________。但可用葡萄糖作为碳源，进入细菌体内的葡萄糖的主要作用是_____________________(答出两点即可)。

(2)为了筛选可分解尿素的细菌，在配制培养基时，应选择________(填“尿素”“NH4NO3”或“尿素＋NH4NO3”)作为氮源，不选择其他两组的原因是____________________________________________________。

(3)用来筛选分解尿素细菌的培养基含有KH2PO4和Na2HPO4，其作用有________________________________________________(答出两点即可)。

解析：(1)土壤中的某些细菌之所以能够分解尿素，是因为它们能产生脲酶。尿素分解菌是异养生物，不能利用CO2来合成有机物，必须利用现成的有机物(如葡萄糖)作为碳源；葡萄糖通过呼吸作用被分解时，能为细胞生命活动提供能量，同时，葡萄糖还可以转化成脂肪、某些氨基酸等物质，所以进入细菌体内的葡萄糖能为其他有机物的合成提供原料。(2)选择培养基只是允许特定种类的微生物(目的微生物)生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。本实验的目的菌是可分解尿素的细菌，因此配制的培养基应只允许尿素分解菌生长，NH4NO3可以作为所有细菌的氮源，培养基中如含有NH4NO3，将不能起到筛选作用。(3)KH2PO4和Na2HPO4能为细菌生长提供钾盐、钠盐和磷酸盐，而H2PO4/HPO42－－可作为缓冲剂，使培养基中pH保持相对稳定。

答案：(1)脲酶

分解尿素的细菌是异养生物，不能利用CO2来合成有机物

为细胞生命活动提供能量，为其他有机物的合成提供原料

(2)尿素

其他两组都含有NH4NO3，能分解尿素的细菌和不能分解尿素的细菌都能利用NH4NO3，不能起到筛选作用

(3)为细菌生长提供无机营养，作为缓冲剂保持细胞生长过程中pH稳定

探究点二

[共研探究]

土壤中分解尿素的细菌的分离与计数操作流程分析(填图) 下面是土壤中分解尿素的细菌的分离与计数的实验流程示意图，请结合教材提供的资料分析：

实验设计与操作

[总结升华]

1．选择培养基与鉴别培养基

项目

特殊成分

目的

用途

举例

选择培养基

加入某种化学物质

抑制其他微生物生长，促进目的微生物生长

培养、分离出特定微生物

培养酵母菌和霉菌，可在培养基中加入鉴别培养基

加入某种指示剂或化学药品

与微生物的代谢产物或培养基中的成分发生特定反应

鉴别不同的微生物

可用伊红美蓝培养基鉴定饮用水或乳制

青霉素，抑制细菌生长；用以尿素作唯一氮源的培养基来培养尿素分解菌

2.结果分析与评价

内容

品中是否有大肠杆菌(若有，菌落呈黑色) 结论分析

①空白对照组培养基上无菌落生长→未被杂菌污染；②空白对照组培养是否有杂菌污染

基上有菌落生长→被杂菌污染；③实验组选择培养基上菌落形态多样，菌落数偏高→培养基上可能混入其他氮源

选择培养基是否具有筛选作用

样品的稀释操作

重复组的结果

牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目明显多于选择培养基上的菌落数目→选择培养基具有筛选作用

如果得到了2个或2个以上菌落数在30～300的平板→操作成功

若选取的是同一种土样，统计的结果应该接近

[对点演练]

3．用来判断选择培养基是否起到了选择作用，需要设置的对照是(

) A．未接种的选择培养基

B．未接种的牛肉膏蛋白胨培养基

C．接种了的牛肉膏蛋白胨培养基

D．接种了的选择培养基

解析：选C

将菌液稀释相同的倍数并接种，牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目应明显多于选择培养基上的菌落数目，因此，应选择接种菌种的牛肉膏蛋白胨培养基作为对照。对照实验遵循的原则是单一变量原则。

4．如图为“土壤中分解尿素的细菌的分离和计数”实验中样品稀释示意图。据图分析正确的是(

)

A．3号试管中的菌落稀释倍数为103倍

B．4号试管中稀释液进行平板培养得到的菌落平均数可能是5号的10倍

C．5号试管的结果表明每克土壤中的菌株数为1.7×109个

D．该实验方法统计得到的结果往往会比实际活菌数目要高

解析：选B

3号试管稀释倍数是104倍；4号试管中稀释液进行平板培养，稀释倍数比5号的低10倍，如果稀释倍数适当，得到的菌落平均数可能是5号的10倍；5号试管进行稀释涂布平板法计数的结果表明每克土壤中的菌株数为(168＋175＋167)÷3×106×10÷10＝1.7×108(个)；稀释涂布平板得到的菌落可能存在两个或多个细胞长成一个菌落的情况，

故该实验方法统计得到的结果往往会比实际活菌数目要低。

1．(2018·大同月考)分离土壤中分解尿素的细菌，对培养基的要求是(

) 选项

A B C D 尿素

＋

－

＋

＋

琼脂

＋

－

＋

－

葡萄糖

＋

－

＋

－

硝酸盐

＋

－

－

＋

注：“＋”表示加入，“－”表示不加。

解析：选C

分离土壤中分解尿素的细菌，培养基中要有碳源，且以尿素作为唯一的氮源，故不能添加硝酸盐。

2．关于土壤中细菌的分离，下列正确的操作步骤是(

) ①土壤取样

②称取10 g土壤，加入盛有90 mL无菌水的锥形瓶中

③吸取0.1 mL进行平板涂布

④依次稀释至101、102、103、104、105、106、107倍

A．①→②→③→④

C．①→②→④→③

B．①→③→②→④

D．①→④→②→③

解析：选C

在分离土壤中某种细菌时，应先选取土样(10 g)，然后加无菌水获得土壤浸出液，并进行不同倍数稀释，最后将稀释液涂布到培养基表面进行培养，并分离和计数。

3．下列是关于检测土壤中细菌总数实验操作的叙述，其中错误的是(

) A．用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基，经高温、高压灭菌后倒平板

B．取104、105、106倍的土壤稀释液和无菌水各0.1 mL，分别涂布于各组平板上

C．将实验组和对照组平板倒置，37 ℃恒温培养24～48 h D．确定对照组无菌后，选择菌落数在300以上的实验组平板进行计数

解析：选D

对土壤微生物计数，使用的培养基应该是标准培养基，并要经过高压蒸汽灭菌处理；涂布时要对样本的水溶液进行稀释，一般选取104、105、106倍的土壤稀释液各取0.1 mL进行涂布，为了检查平板培养基是否制备合格，要同时把一培养基接种等量无菌水，以作空白对照；培养一段时间后，如果某一稀释倍数的平板上菌落个数在30～300之间，即可把该组所有平板的菌落计数，然后取其平均值，计算出土壤细菌的总数。

4．下表为培养某种微生物的培养基配方，请回答有关问题：

KH2PO4

1.4 g Na2HPO4

2.1 g MgSO4·7H2O 0.2 g 葡萄糖

10.0 g 尿素

1.0 g 蒸馏水

定容至1 000 mL (1)该培养基只允许分解尿素的细菌生长，这种培养基称为________培养基。

(2)若要通过统计培养基中菌落数来估计样品中的细菌数，上述培养基中还需要添加的成分是________，接种时应采用____________法，利用该方法接种培养得到的菌落，不可能是图中的________。

(3)在接种前，随机取若干灭菌后的空白平板培养基先行培养了一段时间，这样做的目的是______________________________。然后，将1 mL土壤溶液分别稀释10倍和100倍，各在3个平板上分别接入每种稀释度的稀释液0.1 mL，经适当培养后，6个平板上的菌落个数分别为59、57、58、2、7和5，据此可得出每升土壤溶液中的活菌数为________个。

(4)从土壤中分离出分解尿素的细菌后，要对其做进一步的鉴定，即在上述培养基中加入________指示剂，培养该菌后，如果指示剂变________，可初步鉴定该种细菌能够分解尿素。

解析：(1)该培养基以尿素为唯一氮源，只允许分解尿素的细菌生长，故这种培养基称为选择培养基。(2)若要通过统计培养基中菌落数来估计样品中的细菌数，需用固体培养基，故上述培养基中还需要添加的成分是琼脂，接种时应采用稀释涂布平板法，利用该法接种培养得到的菌落，不可能是图中的D，因图D利用的是平板划线法。(3)在接种前，随机取若干灭菌后的空白平板培养基先行培养一段时间，观察培养基上有无菌落形成，目的是检测培养基灭菌是否合格。统计时应选取菌落个数在30～300的平板，故每升土壤溶液中的活菌数为(59＋57＋58)÷3×10÷0.1×1 000＝5.8×106(个)。(4)由于细菌分解尿素的过程中产生了氨，氨能使培养基的pH升高，故从土壤中分离出分解尿素的细菌后，要对其做进一步的鉴定，即在培养基中加入酚红指示剂，培养该菌后，如果指示剂变红，可初步鉴定该种细菌能够分解尿素。

答案：(1)选择

(2)琼脂

稀释涂布平板

D

(3)检测培养基灭菌是否合格

5.8×106

(4)酚红

红

【基础题组】

1．产生标准形态菌落的细菌的最初数目和培养基分别是(

) A．一个细菌、液体培养基

B．许多细菌、液体培养基

C．一个细菌、固体培养基

D．许多细菌、固体培养基

解析：选C

在液体培养基中生活的细菌，无论是一个还是许多，肉眼都看不见。当固体培养基上有许多细菌并且集中在较小范围内时，肉眼可见。而菌落是一个细菌或几个细菌的子细胞群体，形成于固体培养基上，有一定的形态结构，所以肉眼可见。同种细菌形成的菌落，形态结构是相同的。许多细菌形成的菌落，不可能有比较标准的形态，因为许多细菌不可能是同一种细菌，也不可能在培养基的同一个点上。

2．下列属于菌落特征的是(

) ①菌落的形状

②菌落的大小

③菌落的多少

④隆起程度

⑤颜色

⑥有无荚膜

A．①②③④

C．②③④⑥

B．①②④⑤

D．①②③④⑤⑥

解析：选B

不同种类的细菌所形成的菌落大小、形状、光泽度、颜色、硬度、透明度等具有一定特征，所以每种细菌在一定条件下所形成的菌落，可以作为菌种鉴定的重要依据。单个细菌用肉眼是看不见的，故细菌的个体特征——有无荚膜不能作为菌种鉴定的依据。

3．测定土壤中细菌数量一般选用104、105和106倍的稀释液进行平板培养，而测定真菌的数量一般选用102、103和104倍稀释液，其原因是(

) A．细菌个体小，真菌个体大

B．细菌易稀释，真菌不易稀释

C．细菌在土壤中数量比真菌多

D．随机的，没有原因

解析：选C

土壤中的微生物大约70%～90%是细菌，真菌的数量要比细菌少。样品的稀释度越高，在平板上生长的菌落数目就越少。在实际操作中，通常选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得菌落数在30～300之间，适于平板计数，所以细菌的稀释倍数要高于真菌的稀释倍数。

4．想要对土壤中分解尿素的细菌进行分离与计数，下列操作需要在酒精灯火焰旁进行的有(

) ①土壤取样

②称取土壤

③稀释土壤溶液

④涂布平板

⑤微生物的培养

A．①②③④⑤

C．③④⑤

B．②③④⑤

D．②③④

解析：选D

对土壤中分解尿素的细菌进行分离与计数时，称取土壤、稀释土壤溶液和涂布平板都在火焰旁进行；土壤取样在野外进行；微生物的培养在恒温箱中进行。

5．在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂的目的是(

)

A．对分离的菌种作进一步的鉴定

B．筛选出能分解尿素的细菌

C．培养基中还缺乏酚红指示剂作细菌的营养物质

D．如指示剂变蓝就能准确地认定该菌能分解尿素

解析：选A

加入酚红指示剂的目的是对分离的菌种作进一步的鉴定；用以尿素为唯一氮源的培养基筛选出能分解尿素的细菌不是加入酚红指示剂的目的；酚红指示剂不能作为细菌的营养物质；如指示剂变红就能准确地认定该菌能分解尿素。

6．用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数，在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下几种统计结果，正确的是(

) A．涂布了一个平板，统计的菌落数是230 B．涂布了两个平板，统计的菌落数是215和260，取平均值238 C．涂布了三个平板，统计的菌落数分别是21、212和256，取平均值163 D．涂布了三个平板，统计的菌落数分别是210、240和256，取平均值235 解析：选D

在设计实验时，一定要涂布至少三个平板，作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性；C项中虽涂布了三个平板，但是，其中一个平板的计数结果与另两个相差太大，说明在操作过程中可能出现了错误，因此不能用这三个平板的计数来求平均值。

7．通过选择培养基可以从混杂的微生物群体中分离出所需的微生物。在缺乏氮源的培养基上，大部分微生物无法生长；在培养基中加入青霉素可以抑制细菌和放线菌生长；在培养基中加入10%的酚可以抑制细菌和霉菌生长。利用上述方法能从混杂的微生物群体中分离出(

) ①大肠杆菌

②霉菌

③放线菌

④固氮细菌

A．①②③

C．①③

B．④②③

D．①②④

解析：选B

在缺乏氮源的培养基上大部分微生物无法生长，但固氮细菌能生长；在培养基中加入青霉素可以抑制细菌和放线菌生长，从而分离出霉菌；10%的酚可以抑制细菌和霉菌的生长，从而分离出放线菌。

8．下列关于土壤中分解尿素的细菌的分离与计数的叙述，正确的是(

) A．只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素

B．筛选分解尿素的细菌时应以尿素作为培养基中的唯一营养物质

C．统计样品中的活菌数目时一般用平板划线法

D．在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，若指示剂变蓝，则表明筛选到了分解尿素的细菌

解析：选A

只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素；筛选分解尿素的细菌的实验中，利用的是以尿素为唯一氮源的培养基；统计样品中的活菌数目一般用稀释涂布平板法；在

以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将变红，就能初步鉴定该种细菌能够分解尿素。

【能力题组】

9．甲、乙、丙是三种微生物，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ是用来培养微生物的三种培养基(如下表)。甲、乙、丙都能在Ⅲ中正常生长繁殖，甲能在Ⅰ中正常生长繁殖，而乙和丙都不能；乙能在Ⅱ中正常生长繁殖，甲、丙都不能。下列说法正确的是(

) 成分

粉状硫10 g KH2PO4 4 g FeSO4 0.5 g 蔗糖10 g (NH4)2SO4 0.4 g H2O 100 mL MgSO4·7H2O 9.25 g CaCl2 0.5 g Ⅰ

＋

＋

＋

＋

－

＋

＋

＋

Ⅱ

＋

＋

＋

－

＋

＋

＋

＋

Ⅲ

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

注：“＋”表示培养基中加入了这种物质，“－”表示培养基中没有加入这种物质。

A．甲、乙、丙都是异养微生物

B．甲、乙都是自养微生物，丙是异养微生物

C．甲是异养微生物，乙是固氮微生物，丙是自养微生物

D．甲是固氮微生物，乙是自养微生物，丙是异养微生物

解析：选D

利用不同的选择培养基可分离出我们所需的微生物。从表格中可看出，Ⅰ培养基中无氮源，Ⅱ培养基中无碳源，Ⅲ为完全培养基。由此可知能在Ⅰ中生存的甲只能是固氮微生物，能在Ⅱ中生存的乙是自养微生物，丙只能在Ⅲ中存活，为异养微生物。

10．下列说法错误的是(

) A．因为土壤中各类微生物的数量不同，所以为获得不同类型的微生物，要按不同的稀释倍数进行分离

B．测定土壤中细菌数量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围不同

C．只有得到了3个或3个以上菌落数目在30～300的平板，才说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数

D．牛肉膏蛋白胨培养基的菌落数明显大于选择培养基的数目，说明选择培养基已筛选出一些细菌菌落

解析：选C

样品的稀释度直接影响平板上生长的菌落数目，土壤中各类微生物数量

不同，含量最多的是细菌，大约占70%～90%，其次是放线菌，最少的是真菌，所以为获得不同类型的微生物，要按不同稀释倍数进行分离；在同一稀释度下只要得到两个或两个以上的菌落数目在30～300的平板，说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数；验证选择培养基是否具有选择作用，需设立牛肉膏蛋白胨培养基作为对照，若后者的菌落数明显大于前者，说明前者具有筛选作用。

11．某研究小组欲研究被石油污染过的土壤中细菌的数量，并从中筛选出能分解石油的细菌。下列操作错误的是(

) A．称取和稀释被污染的土壤时应在酒精灯火焰旁

B．用以石油为唯一碳源的培养基进行筛选

C．分离菌种时可采用稀释涂布平板法接种

D．对细菌进行计数时宜采用平板划线法接种

解析：选D

微生物的分离和培养的关键技术是无菌技术，因此在微生物的分离和培养过程中称取和稀释土壤时应在酒精灯火焰旁进行；筛选出能分解石油的细菌，培养基的配方应以石油为唯一碳源；对微生物进行分离可用稀释涂布平板法或平板划线法；对微生物进行计数时只能用稀释涂布平板法。

12．苯酚是工业生产排放的有毒污染物质，自然界中存在着降解苯酚的微生物。某工厂产生的废水中含有苯酚，为了降解废水中的苯酚，研究人员从土壤中筛选获得了只能利用苯酚的细菌菌株，筛选的主要步骤如图所示，①为土壤样品。下列相关叙述错误的是(

)

A．图中②培养目的菌株的选择培养基中应加入苯酚作为碳源

B．如果要测定②中活细菌数量，常采用稀释涂布平板法

C．若图中④为对照实验，则其中应以苯酚作为唯一碳源

D．使用平板划线法可以在⑥上获得单菌落

解析：选C

若④为对照实验，则④中培养基应含除苯酚外的其他碳源，⑤中以苯酚作为唯一碳源。

13．如图表示某同学从土壤中筛选出能降低尿素含量的菌株的实验流程。请回答下列有关问题：

配制土壤溶液→系列稀释→涂布平板与培养→菌落计数

(1)实验中应用以________为唯一氮源的培养基筛选能分解尿素的细菌。从功能上讲，该培养基属于________培养基。

(2)将样液进行一系列的梯度稀释，然后接种培养。在稀释土壤溶液的过程中每一步都要在______________旁进行操作。稀释处理的目的是__________________，将接种后的培

养皿倒置放在温度适宜的恒温箱中培养，平板倒置培养的目的主要是________________________________。

(3)配制培养基时，需添加琼脂，琼脂起________作用；培养基中添加________作为指示剂，可使目标菌落的周围产生红色环带。

(4)该同学在接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先行培养了一段时间，这样做的目的是______________________；然后将1 mL样液稀释1 000倍，在3个平板上用涂布法分别接入0.1 mL稀释液；经适当培养后，3个平板的菌落数分别为49、47和45。据此可得出每升样液中分解尿素的微生物活菌数为________个，理论上，统计的菌落数往往________(填“低”“等”或“高”)于接种的实际活菌数目。

解析：(1)欲筛选出分解尿素的细菌，培养基中应以尿素为唯一氮源，不能降解尿素的细菌在此培养基上不能生存，这类培养基属于选择培养基。(2)将样液进行一系列的梯度稀释，然后接种培养，为避免杂菌污染，每一步操作都要在酒精灯火焰旁进行。为了得到单个菌落，需将土壤溶液进行一系列的梯度稀释。为防止水蒸气在皿盖上凝结成水滴并落入培养基造成污染，培养皿需要倒置在恒温培养箱中培养。(3)液体培养基中难以得到成型的菌落，而固体培养基上可以形成肉眼可见的菌落，因此需要加入琼脂作为凝固剂。目标细菌合成的脲酶能将尿素分解成氨，氨使培养基pH升高，酚红指示剂变红，因此可加入酚红作为指示剂。(4)将1 mL样液稀释1 000倍，在3个平板上分别接入0.1 mL，经培养后3个平板菌落的平均数是(49＋47＋45)÷3＝47(个)，则每升样液中分解尿素的微生物活菌数为47÷0.1×1 000×1 000＝4.7×108(个)。

答案：(1)尿素

选择

(2)酒精灯火焰

得到单个菌落

防止皿盖上的冷凝水落入培养基，造成污染

(3)凝固

酚红

(4)检测平板培养基灭菌是否合格

4.7×108

低

14．某化工厂的污水池中含有一种有害的难以降解的有机化合物A。研究人员用化合物A、磷酸盐、镁盐以及微量元素配制的培养基，成功筛选到能高效降解化合物A的细菌(目的菌)。实验的主要步骤如图所示。请分析回答下列问题：

(1)培养基中加入化合物A的目的是筛选________，这种培养基属于________培养基。

(2)目的菌生长所需的氮源和碳源是来自培养基中的________，实验需要振荡培养，由此推测目的菌的代谢类型是异养________(填“需氧”或“厌氧”)型。

(3)培养若干天后，应选择培养瓶中化合物A含量________的培养液，接入新的培养液中连续培养，使目的菌的数量________(两空均填“增加”或“减少”)。

(4)转为固体培养基时，常采用______________和稀释涂布平板法进行接种，在前一种

方法接种过程中所用的接种工具是________，这种工具在操作时采用的灭菌方法是________。

(5)某同学计划统计污水池中目的菌的总数，他选用104、105、106稀释液进行涂布平板，每种稀释液都设置3个重复，各吸取0.1 mL稀释液涂布平板，在适宜条件下培养一段时间后，对平板的菌落数进行统计，结果如下：

稀释度(倍) 平板

平板菌落数(个) 1 432 104

2 421 3 445 1 78 105

2 67 3 74 1 9 106

2 6 3 8 为了保证结果准确，应选择上述稀释________倍的平板菌落数作为统计结果，计算出样品中每毫升目的菌菌株数为________个。

(6)测定微生物的数量常采用________________法，其统计的数值往往比实际数目低，原因是________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。

解析：(1)培养基中加入化合物A的目的是筛选目的菌，这种培养基属于选择培养基。(2)目的菌生长所需的氮源和碳源是来自培养基中的化合物A，因为除了化合物A，没有其他的氮源和碳源。实验需要振荡培养，振荡可以增加培养液中的溶氧量，由此推测目的菌的代谢类型是异养需氧型。(3)培养若干天后，应选择培养瓶中化合物A含量减少的培养液，接入新的培养液中连续培养，使目的菌的数量增加。如此操作，可以补充营养物质。(4)接种用到的方法一般有平板划线法和稀释涂布平板法，前一种方法的接种工具是接种针和接种环，这种工具在操作时采用的灭菌方法是灼烧灭菌。(5)应取菌落数在30～300之间的平板进行计数，所以稀释105倍的平板符合要求，则每毫升目的菌菌株数是(78＋67＋74)÷3÷0.1×105＝7.3×107(个)。(6)稀释涂布平板法计算的活菌数比实际值偏小，因为可能有两个或多个细胞形成一个菌落。

答案：(1)目的菌

选择

(2)化合物A

需氧

(3)减少

增加

(4)平板划线法

接种针(环)

灼烧灭菌

(5)105

7.3×107

(6)稀释涂布平板

两个或多个细胞连在一起，观察到的只是一个菌落

15．为研究某品牌酸奶中乳酸菌的数量及其对抗生素的耐药性情况，某同学进行了如下实验：

请分析回答下列问题：

(1)配制的乳酸菌液体培养基除了含有水、碳源、氮源和无机盐等主要营养成分外，还

应加入适量的________。在培养基各成分溶化与灭菌两步骤之间，要进行的操作是____________。

(2)接种微生物的方法有很多，图中过程所表示的方法为________________。用该方法统计样本菌落数时，同时需要做A、B、C三个平板，目的是______________________________。用该方法统计培养基上的菌落数后，所得数据需要乘以10n后，才可表示酸奶样品中乳酸菌的数量(单位：个/mL)，这里的n＝__________。

(3)请完善“检测乳酸菌对青霉素、四环素耐药性”实验的操作步骤：

步骤1：配制三种分别含________________________________的固体培养基，每种培养基制备两组。

步骤2：向其中一组培养基中分别接种待检测的乳酸菌菌种，另一组培养基______________。

步骤3：将这两组培养基都置于相同且适宜的条件下培养一定时间，观察比较培养基中菌落生长情况。

解析：(1)配制的乳酸菌液体培养基除了含有水、碳源、氮源和无机盐等主要营养成分外，还应加入适量的维生素。在培养基各成分溶化与灭菌两步骤之间，要调节培养基的pH。(2)接种微生物的方法有很多，图中过程所表示的方法为稀释涂布平板法，用该方法统计样本菌落数时，同时需要做A、B、C三个平板，分别计数3次，取平均值，使实验结果更加准确可靠。用该方法统计培养基上的菌落数后，所得数据需要乘以10n后，才可表示酸奶样品中乳酸菌的数量(单位：个/mL)，根据图示可知题中n＝6。(3)步骤1：根据等量原则，应该配制三种分别含等量且适量的青霉素、四环素和无菌水的固体培养基，每种培养基制备2组。步骤2：根据对照原则，应该将其中一组培养基接种待检测的乳酸菌菌种，另一组不接种作为对照。步骤3：接种后的一组培养基和未接种的培养基都置于相同且适宜的条件下培养，并在一定时间后进行观察。

答案：(1)维生素

调pH

(2)稀释涂布平板法

分别计数3次，取平均值，使实验结果更加准确可靠

6

(3)等量且适量的青霉素、四环素、无菌水

不接种