课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数优秀教案范文

课题2

土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

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1.能利用选择培养基分离细菌。

2.能运用活菌计数法测定土壤中分解尿素细菌的数量。

一、研究思路

1．筛选菌株

(1)PCR技术要用到一种关键酶——Taq_DNA聚合酶，

这种酶只能在耐高温环境的微生物中获得。

(2)微生物筛选的原理是：

人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，

同时抑制或阻止其他微生物的生长，该类培养基是选择培养基。

2．(1)在稀释涂布平板法和平板划线法两种方法中，前者适合统计样品中活菌的数目。

样品的稀释度要足够高，确保一个菌落来源于一个活菌。

理由：由于在平板划线中，所划的线中只有最后一次划线的末端才会形成由一个细菌形成的菌落，而其他一些菌落往往由两个细菌或多个细菌繁殖而成，而在计数时一个菌落对应着一个细菌，这样在划线所得的平板中，菌落数目低于活菌的实际数值，所以不能用平板划线法测定活菌数量。

(2)用于活菌计数的平板要形成30～300个菌落。

所统计的菌落数往往比活菌的实际数值要低，

原因是两个或多个细胞连在一起时观察到的仅是一个菌落。

3．设置对照：

排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。

4、选择培养基的制作方法

(1)在培养基全部营养成分具备的前提下：

依据某些微生物对某些物质的抗性，在培养基中加入某些物质，以抑制不需要的微生物，促进所需要的微生物生长，

如培养基中加入高浓度食盐时可抑制多种细菌的生长，但不影响金黄色葡萄球菌的生长，从而可将该菌分离出来；而在培养基中加入青霉素时可抑制细菌、放线菌的生长，从而分

离得到酵母菌和霉菌等。

(2)通过改变培养基的营养成分达到分离微生物的目的：

培养基中缺乏氮源时，可分离自生固氮微生物，非自生固氮微生物因缺乏氮源而无法生存；

培养基中若缺乏有机碳源则异养微生物无法生存，而自养微生物可利用空气中的CO2制造有机物生存。

(3)利用培养基的特定化学成分分离特定微生物：

如当石油是唯一碳源时，可抑制不能利用石油的微生物的生长，使能够利用石油的微生物生存，从而分离出能消除石油污染的微生物。

(4)通过某些特殊环境分离微生物：

如在高盐环境中可分离耐盐菌，其他菌在盐浓度高时易失水而不能生存；

在高温环境中可分离得到耐高温的微生物，其他微生物在高温环境中因酶失活而无法生存。

二、实验设计

1．操作步骤：土壤取样→样品的稀释→微生物的培养与观察。

2．土壤取样一般要铲去表层土，

因为绝大多数细菌分布于距地表约3～8_cm的土壤层。

3．样品的稀释：不同的微生物需要稀释的倍数不同，请填写下表

微生物

细菌

放线菌

真菌

4.微生物的培养与观察

微生物的生长受温度的影响，菌落的数目和特征是观察的主要内容。

5、统计菌落的数目

Ⅰ．显微镜直接计数法(总菌计数法) (1)原理：

此法利用特定细菌计数板或血球计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量。

稀释倍数

104、105、106

103、104、105

102、103、104

(2)方法：用计数板计数。

计数板是一块特制的载玻片，上面有一个特定的面积为1 mm2和高为0.1 mm的计数室，在1 mm2的面积里又被划分成25个(或16个)中格，每个中格进一步划分成16个(或25个)小格，但计数室都是由400个小格组成的，如图所示。

(3)计算公式：每毫升原液所含细菌数＝每小格平均细菌数×400×10 000×稀释倍数

(4)缺点：不能区分细菌的死活。

Ⅱ、间接计数法(活菌计数法) (1)原理：

当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。

(2)计算公式：

每克样品中的菌株数＝(C÷V)×M。

其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用稀释液的体积(mL)，M代表稀释倍数。

(3)统计方法：

统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好能统计3个平板，计算出平板上菌落数的平均值，然后按公式进行计算。

三、操作提示

1．无菌操作：取土样用的小铁铲和盛土样的信封在使用前都需要灭菌。

称取土样要在火焰旁进行。

稀释样品要在火焰旁操作。

2．做好标记：

要对平板和试管进行标记，

尤其进行系列稀释时要按稀释度递增顺序将试管排列成行。

四、课题延伸

分解尿素的细菌合成的脲酶将尿素分解成了氨，使培养基的碱性增强。

在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂培养细菌，

若指示剂变红，可以初步鉴定该种细菌能够分解尿素。

2．结果分析与评价

内容

有无杂菌污染的判断

现象

对照的培养皿中无菌落生长

对照的培养皿中有菌落生长

牛肉膏培养基上的菌落数目大于选择培养基上的数目

得到两个或两个以上菌落数目在30～300的平板

结论

未被杂菌污染

被杂菌污染

选择培养基具有筛选作用

选择培养基的筛选作用

样品的稀释操作

重复组的结果

操作成功

若选取同一种土样，统计结果应接近