课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数PPT及专用教学设计内容

课题2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

知识点一：筛选菌株的思路及计数

1．筛选菌株的思路

(1)自然界中目的菌株的筛选：

①依据：根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。

②实例：PCR技术过程中用到的耐高温的Taq DNA聚合酶，就是从热泉中筛选出来的Taq细菌中提取出来的。

(2)实验室中目的菌株的筛选：

①原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物的生长。

②方法：利用选择培养基分离。

a．选择培养基：允许特定微生物生长，同时阻止或抑制其他种类微生物生长的培养基。

b．实例：选择分解尿素的细菌的培养基，以尿素作为唯一氮源，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。

2．统计菌落数目

(1)常用方法：稀释涂布平板法。

①原理

②计数原则：一般选择菌落数在30～300的平板进行计数。

③结果分析：统计的菌落数往往比活菌的实际数目低。原因是当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。

(2)其他方法：利用显微镜直接计数。

1．阅读教材P22第一段旁栏中的相关内容，并思考回答下列问题。

(1)从物理性质上划分，此培养基属于哪类培养基？从功能上划分呢？

提示：固体培养基，因为加入了凝固剂琼脂。从功能上看属于选择培养基。

(2)在培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是什么物质？

提示：碳源主要是葡萄糖，氮源是尿素。

(3)该培养基对微生物是否具有选择作用？如果具有，是如何进行选择的？

提示：该培养基对微生物有选择作用。该培养基以尿素为唯一氮源，只允许能以尿素

作为氮源的微生物生长。

2．阅读教材P22中部楷体字部分，思考：

哪位同学的结果更接近真实值？他们的实验需要改进吗？如果需要，如何改进？

提示：第一位同学只涂布了1个平板，没有设置重复组，因此结果不具有说服力。第二位同学考虑到设置重复组的问题，涂布了3个平板，但是，其中1个平板的计数值结果与另2个相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误，因此，不能简单地将3个平板的计数值用来求平均值，这两位同学的实验都需要改进。在设计实验时，一定要涂布至少3个平板作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性。在分析实验结果时，一定要考虑所设置的重复组的结果是否一致。结果不一致，意味着操作有误，需要重新实验。

3．阅读教材P23上部的楷体字部分，请帮助A同学设置对照实验，以排除其他同学所质疑的可能影响实验结果的因素。

提示：

可能原因

所取土样不同

培养基污染或操作失误

实验验证

其他同学用与A同学一样的土样进行实验

将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作空白对照

结

论

若结果与A同学的一致，则说明A无误；若结果与A同学的不一致，则说明A同学操作失误或培养基配制有问题

若有菌落出现，则说明培养基污染；若无菌落出现，则说明未被污染

1．选择培养基的类型及作用

(1)在培养基中加入某种化学物质。如加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌；加入高浓度的食盐可得到金黄色葡萄球菌。这里的加入指的是在培养基的培养成分的基础上加入。

(2)改变培养基中的营养成分。如培养基中缺乏氮源时，可以分离固氮微生物，因为非固氮微生物不能在此培养基上生存。当培养基的某种营养成分为特定化学成分时，也具有分离效果。

(3)改变微生物的培养条件。如将培养基放在高温环境中培养只能得到耐高温的微生物。

2．统计菌落数目

(1)稀释涂布平板法：

①原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数。

②注意事项：

a．设置重复组：同一稀释度下，至少涂布3个平板作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性。分析结果时，需考虑重复组的结果是否一致，结果不一致，意味着操作有误，需要重新实验。

b．设置对照：目的是排除实验中非测试因素对实验结果的影响，提高实验的可信度。

③计算公式：每克样品中的菌株数＝(C÷V)×M。

C：代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数。

V：代表涂布平板时所用的稀释液的体积。

M：代表稀释倍数。

(2)显微镜直接计数法：

①原理：此法利用特定细菌计数板或血球计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量。

②缺点：不能区分细菌的死活。

③方法：用计数板计数。计数板是一块特制的载玻片，上面有一个特定的面积为1 mm2和高为0.1 mm的计数室，在1 mm2的面积里又被划分成25个(或16个)中格，每个中格进一步划分成16个(或25个)小格，但计数室都是由400个小格组成的。如下图所示：

④计算公式：每毫升原液所含细菌数＝每小格平均细菌数×400×10 000×稀释倍数。

知识点二：实验设计及操作提示

1．实验设计流程

2．菌种鉴定

(1)原理：分解尿素的细菌合成的脲酶将尿素分解为氨，使培养基的碱性增强。

(2)方法：在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂培养细菌，若指示剂变红，可确定该种细菌能够分解尿素。

1．为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？

提示：土壤中各类微生物的数量不同，因此，为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。

2．当第一次测定时为什么要将稀释的范围放宽一些？

提示：为确保能从中选择出菌落数在30～300之间的平板进行计数。

3．为什么要选取菌落数目稳定时的记录作为结果？

提示：防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。

1．操作中的注意事项

(1)无菌操作：铁铲和信封都要灭菌。称取土壤、将称好的土样倒入锥形瓶、稀释土壤溶液，每一步都要在酒精灯的火焰旁进行。

(2)做好标记：如在培养皿上注明培养基种类、培养日期以及培养样品的稀释度等。

2．结果分析与评价

内

容

有无杂菌污染的判断

选择培养基的筛选作用

现

象

未接种的培养基上无菌落生长

牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数大于选择培养基上的菌落数

得到2个或2个以上菌落数目在30～300的平板

结

论

未被杂菌污染

选择培养基具有筛选作用

样品的稀释操作

重复组的结果

操作成功

若选择同一种土样，统计结果应接近

选择培养基的特点和应用

[例1]

下表是某微生物培养基的配方。请分析回答下列问题：

编号

成分

含量

①

(NH4)2SO4

0.4 g ②

KH2PO4

4.0 g ③

FeSO4

0.5 g ④

CaCl2

0.5 g ⑤

H2O 100 mL (1)从培养基的营养成分看，此培养基可用来培养的微生物同化作用类型是________。利用该培养基培养微生物时，微生物所需要的碳源来自__________________________。

(2)此表中含有的微生物的营养成分包括________________________。

(3)若除去该培养基中的①后再加入不含氮元素的有机物，则此培养基可培养的微生物

种类是________________________。

(4)培养基若加入氨基酸，则它可充当的营养成分是_________________________。

(5)若要观察微生物的菌落的特点，培养基中还应添加的成分是____________________。

[解析]

自养型微生物可以利用空气中的二氧化碳作为碳源，故培养基中可以不含碳源；自生固氮微生物则可以利用空气中的氮气作为氮源，培养基中可以不含氮源；氨基酸中含碳元素和氮元素，可作为微生物的碳源和氮源，还可以满足微生物对特殊营养物质的需求；若要观察微生物的菌落特点，必须使用固体培养基，因此培养基中还应添加凝固剂，如琼脂。

[答案]

(1)自养型

空气中的CO2

(2)水、无机盐、氮源

(3)自生固氮微生物

(4)碳源、氮源和特殊营养

(5)凝固剂(琼脂) 归纳拓展

几种常见微生物的分离方法

根据选择培养的菌种的生理代谢特点，加入某种物质或不加入某种物质以达到选择的目的。常见微生物的分离举例如下：

①酵母菌、霉菌等真菌：用含青霉素的培养基分离；

②金黄色葡萄球菌：用含高浓度食盐水的培养基分离；

③固氮微生物：用缺乏氮源的培养基分离；

④自养型微生物：用含无机碳源的培养基分离；

⑤厌氧型和兼性厌氧型微生物：用普通培养基在无氧条件下分离。

微生物的分离与计数

[例2] 自然界中的微生物往往是混杂生长的。人们在研究微生物时一般要将它们分离提纯，然后进行数量的测定。下面是对大肠杆菌进行数量测定的实验，请回答有关问题。

实验步骤：

(1)制备稀释倍数为102、103、104、105、106的系列稀释液。

(2)选用______________法接种样品。

(3)适宜温度下培养。

结果分析：

(1)测定的大肠杆菌数，在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下几种统计结果，正确可信的是( ) A．一个平板，统计的菌落数是23 B．两个平板，统计的菌落数分别是22和26，取平均值24 C．三个平板，统计的菌落数分别是21、5和52，取平均值26 D．四个平板，统计的菌落数分别是21、30、24和25，取平均值25 (2)一同学在稀释倍数为105的培养基中测得平板上菌落数的平均值为23.4，那么每毫升样品中的菌株数是(涂布平板时所用稀释液的体积为0.2 mL)____________。

(3)用这种方法测定密度，实际活菌数量要比测得的数量________，因为________________________________________________________________________。

(4)某同学在测定大肠杆菌的密度时发现，在培养基上还有其他杂菌的菌落，能否肯定该大肠杆菌的品系被污染了？为什么？

[解析]

实验步骤：(2)若要对大肠杆菌进行计数，常用稀释涂布平板法接种样品。

结果分析：(1)在选取样品时，应选取多个菌落数相差不大的平板计数，取其平均值。

平均菌落数(2)每毫升样品中菌株数＝稀释液体积×稀释倍数，

即23.4÷0.2×106＝1.17×108。

(3)由于菌落可能由1个或多个细菌连在一起生长而成的，所以实际活菌数量比测得数量多。

(4)污染的原因可能是菌种不纯，也可能是培养基灭菌不彻底或接种过程操作不当。

[答案]

实验步骤：(2)稀释涂布平板

结果分析：(1)D

(2)1.17×108

(3)多

当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察的是一个菌落

(4)不能。因为不能排除杂菌来自培养基或培养过程。

易错提醒

本题易错原因是不理解菌落数目的统计规则。实验时，每一个浓度至少涂布三个平板，以增强实验的说服力和准确性。当样品的稀释倍数足够高时，培养基表面生长的一个菌落来源于样品稀释液中的一个活菌。计数时选择菌落数在30～300的平板计数，若某两个或多个稀释浓度下获得的菌落数符合条件时，再看两者菌落数的比值：若小于2，则取两者的平均值；若大于2，则取小者。

1．在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基称作( ) A．鉴别培养基

B．加富培养基

C．选择培养基

D．基础培养基

解析：选C

鉴别培养基是在培养基中加入某种特殊化学物质，微生物的代谢产物与特殊化学物质发生特定化学反应，产生明显特征变化；加富培养基一般用来培养营养要求比较苛刻的异养型微生物；基础培养基是含有一般微生物生长繁殖所需的基本营养物质的培养基，例如牛肉膏蛋白胨培养基；选择培养基是在培养基中加入特殊营养物质或化学物质，抑制不需要微生物的生长，有利于所需微生物生长的培养基。

2．请选出下列正确的操作步骤( ) ①土壤取样

②称取10 g土壤，加入盛有90 mL无菌水的锥形瓶中

③吸取0.1 mL进行平板涂布

④依次稀释至101、102、103、104、105、106、107稀释度

A．①→②→③→④

D．①→③→②→④

C．①→②→④→③

D．①→④→②→③

解析：选C

在分离土壤中某细菌时，应先选取土样(10 g)，然后加无菌水获得土壤浸出液，并进行不同倍数稀释，最后将稀释液涂布到培养基表面进行培养，并分离和计数。

3．某研究小组欲研究被石油污染过的土壤中细菌的数量，并从中筛选出能分解石油的细菌。下列操作错误的是( ) A．称取和稀释被污染的土壤时应在火焰旁

B．用以石油为唯一碳源的培养基进行筛选

C．分离菌种时可采用稀释涂布平板法接种

D．对细菌进行计数时宜采用平板划线法接种

解析：选D

微生物的分离和培养的关键技术是无菌操作，因此在微生物的分离和培养的过程中称取和稀释土壤时应在火焰旁进行；阅读题干可知实验目的是筛选出能分解石油的细菌，培养基的配方应以石油为唯一碳源；对微生物进行分离和计数，应该用稀释涂布平板法；分离菌种常用的接种方法是平板划线法和稀释涂布平板法，但对活菌进行计数常用稀释涂布平板法而不能用平板划线法。

4．(2014·新课标Ⅱ)为了调查某河流的水质状况，某研究小组测定了该河流水样中的细菌含量，并进行了细菌分离等工作。回答下列问题：

(1)该小组采用稀释涂布平板法检测水样中的细菌含量。在涂布接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先行培养了一段时间，这样做的目的是________________________________；然后，将1 mL水样稀释100倍，在3个平板上用涂布法分别接入0.1 mL稀释液；经适当培养后，3个平板上的菌落数分别为39、38和37。据此可得出每升水样中的活菌数为________________________________________________________________________。

(2)该小组采用平板划线法分离水样中的细菌。操作时，接种环通过________灭菌，在第二次及以后的划线时，总是从上一次划线的末端开始划线。这样做的目的是_________ ________________________________________________________________________。

(3)示意图A和B中，________表示的是用稀释涂布平板法接种培养后得到的结果。

(4)该小组将得到的菌株接种到液体培养基中并混匀，一部分进行静置培养，另一部分进行振荡培养。结果发现：振荡培养的细菌比静置培养的细菌生长速度快。分析其原因是：振荡培养能提高培养液中____________的含量，同时可使菌体与培养液充分接触，提高________的利用率。

解析：(1)为了检测培养基平板灭菌是否合格，可在涂布接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先行培养一段时间。0.1 mL稀释液中平均有38个活菌，可推测每升水样中的活菌

数＝38×10×100×1 000＝3.8×107(个)。(2)接种环、接种针或其他金属用具直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧，可以迅速彻底地灭菌。在第二次及以后的划线时，总是从上一次划线的末端开始划线，其目的是将聚集的菌体逐步稀释以便获得单个菌落。(3)比较两图可以看出，A是用平板划线法接种培养后得到的结果，B是用稀释涂布平板法接种培养后得到的结果。(4)由于振荡培养可以提高培养液中溶解氧的含量，还可以使菌体与培养液充分接触，提高营养物质的利用率，因此振荡培养的细菌比静置培养的细菌生长速度快。

答案：(1)检测培养基平板灭菌是否合格

3.8×107

(2)灼烧

将聚集的菌体逐步稀释以便获得单个菌落

(3)B

(4)溶解氧

营养物质

[课时跟踪检测] (满分50分

时间25分钟) 一、选择题(每小题3分，共24分) 1．下列关于土壤取样的叙述错误的是( ) A．土壤取样，应选取肥沃、湿润的土壤

B．先铲去表层土3 cm左右，再取样

C．取样用的小铁铲和信封在使用前不用灭菌

D．应在火焰旁称取土壤

解析：选C

微生物的培养要注意无菌操作，土壤取样用的小铁铲和信封在使用前需灭菌，后续稀释等操作均需在火焰旁进行。

2．可以鉴定出分解尿素的细菌的方法是( ) A．以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂

B．以尿素为唯一氮源的培养基中加入二苯胺试剂

C．以尿素为唯一氮源的培养基中加入苏丹Ⅲ试剂

D．以尿素为唯一氮源的培养基中加入双缩脲试剂

解析：选A

在以尿素为唯一氮源的培养基中，不能分解尿素获得氮源的细菌不能生长，而分解尿素的细菌能以尿素为氮源，将尿素分解为氨，使pH升高。若培养基中加入酚红指示剂，指示剂将变红。此培养基既属于选择培养基，又属于鉴别培养基。

3．用来判断选择培养基是否起到了选择作用需要设置的对照是( ) A．未接种的选择培养基

B．未接种的牛肉膏蛋白胨培养基

C．接种了的选择培养基

D．接种了的牛肉膏蛋白胨培养基

解析：选D

选择的目的是为了分离、筛选，对照遵循的原则是单一变量，因此用接种了的普通培养基和选择培养基进行对照，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目。

4．在土壤中分解尿素的细菌的分离与计数实验操作中，对使用的平板和试管要进行标记，以下说法正确的是( ) A．对培养皿仅需注明培养基的种类即可

B．一般在使用之后进行标记

C．由于试管用得较多，只需对试管进行标记即可

D．标记的目的主要是为了防止实验中平板、试管等的混淆

解析：选D

本实验使用的平板和试管较多，为避免混淆，应在使用前就做好标记。标记时要注明培养基种类、培养日期以及平板上培养样品的稀释度等。

5．下列关于“检测土壤中细菌总数”实验操作的叙述，错误的是( ) A．用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基，经高温、高压灭菌后倒平板

B．取104、105、106倍的土壤稀释液和无菌水各0.1 mL，分别涂布于各组平板上

C．将实验组和对照组平板倒置，37 ℃恒温培养24～48 h D．利用稀释涂布平板法只能分离微生物不能对微生物进行计数

解析：选D

检测土壤中细菌总数，用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基，经高温、高压灭菌后倒平板；取104、105、106倍的土壤稀释液和无菌水各0.1 mL，分别涂布于各组平板上；将实验组和对照组平板倒置，37 ℃恒温培养24～48 h；用稀释涂布平板法可以分离微生物也可以对微生物进行计数。

6．通过选择培养基可以从混杂的微生物群体中分离出所需的微生物。在缺乏氮源的培养基上大部分微生物无法生长；在培养基中加入青霉素可以抑制细菌和放线菌的生长；在培养基中加入10%的酚可以抑制细菌和霉菌的生长。利用上述方法能从混杂的微生物群体中分别分离出( ) ①大肠杆菌

②霉菌

③放线菌

④固氮细菌

A．④②③

C．①③④

B．①②③

D．只有③④

解析：选A

缺乏氮源的培养基上大部分微生物无法生长，而固氮细菌能生长；在培养基中加青霉素可以抑制细菌和放线菌等原核生物细胞壁的合成，而霉菌属于真核生物，故能生长；在培养基中加入10%的酚可以抑制细菌和霉菌的生长，对放线菌的生长无影响。

7．分离土壤中分解尿素的细菌，对培养基的要求是( ) ①加尿素

②不加尿素

③加琼脂

④不加琼脂

⑤加葡萄糖

⑥不加葡萄糖

⑦加硝酸盐

⑧不加硝酸盐

A．①③⑤⑦

C．①③⑤⑧

B．②④⑥⑧

D．①④⑥⑦

解析：选C

分离分解尿素的细菌，应该以尿素为唯一氮源，不能加硝酸盐来提供氮源。

另外还要加葡萄糖提供碳源，加琼脂作为凝固剂，制成固体培养基，利于细菌的分离、鉴定、计数等。

8．实验测定链霉素对3种细菌的抗生素效应，用3种细菌在事先准备好的琼脂平板上画3条等长的平行线(3条线均与图中的链霉素带接触)，将平板置于37 ℃条件下恒温培养3天，结果如图所示。从实验结果分析，以下叙述错误的是( )

A．链霉素能阻止结核菌的生长

B．链霉素对结核菌比对霍乱菌更有效

C．链霉素对结核菌比对伤寒菌更有效

D．链霉素可以用于治疗伤寒病人

解析：选D

图中细菌生长区离链霉素带越远，说明该菌对链霉素越敏感，即链霉素越能阻止该菌的生长。读题图可知伤寒菌生长区与链霉素带相连接，说明链霉素不能阻止伤寒菌的生长。

二、非选择题(共26分) 9．(12分)图甲是从土壤中筛选产脲酶细菌的过程，图乙是脲酶基因转录的mRNA部分序列。

(1)图中选择培养基应以________为唯一氮源；鉴别培养基还需添加________作指示剂，产脲酶细菌在该培养基上生长一段时间后，其菌落周围的指示剂将变成________色。

(2)在5个细菌培养基平板上，均接种稀释倍数为105的土壤样品溶液0.1 mL，培养一段时间后，平板上长出的细菌菌落数分别为13、156、462、178和191。

该过程采取的接种方法是__________________，每克土壤样品中的细菌数量为________×108个；与血细胞计数板计数法相比，此计数方法测得的细菌数较________。

解析：(1)脲酶能够催化尿素分解释放出氨和二氧化碳，因此选择培养基中应以尿素为唯一氮源。挑取单菌落接种到加有酚红指示剂的鉴别培养基中，培养一段时间后，菌落周围的氨增加，pH升高，酚红指示剂将变红。(2)该过程采取的接种方法为稀释涂布平板法。

利用稀释涂布平板计数法对细菌进行计数时，应选择菌落数在30～300的平板，因此平板上长出的细菌菌落平均数为(156＋178＋191)÷3＝175个。每克土壤样品中的细菌数为175÷0.1×105＝1.75×108个。血细胞计数板计数法能将死细胞计算在内，而稀释涂布平板计数法只能计数活细胞(只有活细胞才能在平板上生长)，故一般血细胞计数板计数法要比稀释涂布平板计数法的结果大。

答案：(1)尿素

酚红

红

(2)稀释涂布平板法

1.75

少

10．(14分)尿素是一种重要的农业氮肥，不能直接被农作物吸收，只有当土壤中的微生物将尿素分解后才能被植物吸收利用。因此，对土壤中分解尿素的微生物进行分离和鉴定具有重要意义。回答下列问题：

(1)对土壤中分解尿素的微生物的分离过程如下：

第一步：土壤取样。取土样用的工具和盛土样的信封等在使用前都需要__________(填“消毒”或“灭菌”)。

第二步：样品稀释。通常分离不同种类的微生物要采用不同的稀释度，原因是________________________________________________________________________。

第三步：微生物的培养与观察。将一定稀释度的样品接种在以尿素为唯一氮源的培养基上，并在适宜的条件下培养。分解尿素的微生物能在该培养基上生长繁殖，而______________________则不能生长繁殖。

(2)若对土壤悬液进行梯度稀释时，未经振荡而直接取上层悬液进行梯度稀释，用稀释倍数为104的样液涂布到平板上进行培养和计数，统计出的菌落数往往比正确操作统计出的菌落数________。

(3)若要对上述初步筛选出的分解尿素的微生物作进一步的鉴定，需在如表所示培养基配方中添加的物质是________、________。若分离得到的是尿素分解菌，则培养基中pH升高使酚红指示剂变为红色，pH升高的原因是____________________________________________________________________

。

成分

培养基

(含量)

答案：(1)灭菌

土壤中各类微生物的数量不同

不能利用尿素的微生物

(2)偏高

(3)葡萄糖

琼脂

尿素分解菌合成的脲酶将尿素分解成氨

1.4 g 2.1 g 0.2 g 0.01 g 1.0 g 1 000 mL KH2PO4

Na2HPO4

MgSO4·

7H2O 酚红

指示剂

尿素

蒸馏水