课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数名师教学视频（文字实录）

2.2

土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

教学目标：掌握筛选菌株的思路及统计菌落数目的方法；

实验设计及操作提示

教学重点：筛选菌株的思路及统计菌落数目的方法

教学难点：实验设计及操作提示

知识点一 筛选菌株的思路及统计菌落数目的方法

1．筛选菌株的思路

(1)自然界中目的菌株的筛选：

①依据：根据它对 的要求，到相应的环境中去寻找。②实例：PCR技术过程中用到的 酶，就是从热泉中筛选出来的Taq细菌中提取出来的。

(2)实验室中目的菌株的筛选：

①原理：人为提供有利于 生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时 其他微生物的生长。

②方法：利用选择培养基分离。

a．选择培养基：允许 微生物生长，同时 其他种类微生物生长的培养基。

b．实例：选择分解尿素的细菌的培养基，以 作为唯一氮源，只有能合成 的微生物才能分解尿素。

2．统计菌落数目

(1)常用方法： 法。

①原理

a、当样品的稀释足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于增品稀释液中的 ；b、通过统计平板上的菌落数不推测样品中大约含有的 。

②计算公式：每克样品中的菌株数＝C.V.M。

C：代表某一稀释度下平板上生长的 。

V：代表涂布平板时所用的稀释液的 。

M：代表 。

③注意事项：

a．为了保证结果准确，一般设置 个平板，选择菌落数在30～300的平板进行计数，并取 。

b．统计的菌落数往往比活菌的实际数目 。原因是当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是 。因此，统计结果一般用 而不是用 来表示。

c．设置对照：主要目的是排除实验组中 对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。

(2)其他方法：利用 直接计数。

[思考]

1．阅读教材P22第一段旁栏中的相关内容，并思考回答下列问题：

(1)在培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是什么物质？琼脂的作用是什么？

。

(2)该培养基对微生物是否具有选择作用？如果具有，是如何进行选择的？

(3)该培养基属于何种类型？

。

2．教材中P22楷体字部分所列举的两位同学对菌落数的统计，哪位同学的结果更接近真实值？

[重难点]

1．选择培养基的选择作用

(1)原理：根据不同微生物的特殊营养要求或其对某化学、物理因素的抗性不同而制备培养基。

(2)方法：

①在培养基中加入某种化学物质。例如，加入 可以分离出酵母菌和霉菌；加入高浓度的食盐可以得到 。

②改变培养基中的营养成分。

例如，缺乏氮源时可以分离 微生物； 作为唯一碳源时，可以分离出能消除石油污染的微生物；用含无机碳源的培养基分离 微生物。

③改变微生物的培养条件。例如，将培养基放在 环境中培养可以得到耐高温的微生物；用普通培养基在 条件下分离厌氧型和兼性厌氧型微生物。

1

2．显微镜直接计数法

(1)原理：此法利用特定细菌计数板或 ，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量。

(2)方法：

用 计数。计数板是一块特制

的 ，上面有一个特定的面积为1 mm2和高为0.1 mm的计数室，在1 mm2的面积里又被划分成25个(或16个)中格，每个中格进一步划分成16个(或25个)小格，但计数室都是由400个小格组成的。如下图所示。

(3)计算公式：每毫升原液所含细菌数＝ ×400×10 000×稀释倍数。

(4)缺点：不能区分细菌的死活。

[提醒]

显微镜直接计数的操作步骤

①取清洁无油的血球计数板，在计数室上面加 。

②取菌液，摇匀，用滴管吸取菌液在盖玻片边缘滴一小滴，使菌液 ，计数室内不得有气泡。

③用显微镜10×物镜观察并将计数室移至 。

④在10×物镜下计数：计数5个(或4个)中格的总菌数，然后求得每个中格的菌数

的 ，再乘以16(或25)就得出计数区的总菌数，最后再换算出每毫升菌液中的含菌数。

⑤注意事项：在计数边线上的细菌时 。

3．直接计数法与间接计数法的比较

微生物生长量的测定有 法、重量法、生理指标法等，但是一般使用计数法，计数法可分为直接计数法和间接计数法。二者比较如下：

主要用具

计数依据

优点

缺点

计算公式

直接计数法

（ ）、细菌计数板

菌株本身

计数方便、操作简单

死菌、活菌都计算在内

每毫升原液含菌株数＝400×1 0000×每小格平均菌株数×稀释倍数

间接计数法

培养基

培养基上 数

计数的是 。

操作较复杂，且有一定误差

每毫升原液含菌株平均菌落数×稀释倍数

所用涂布液的体积mL数＝知识点二

实验设计及操作提示

1．实验设计

（1）土壤取样

①取样原因：土壤有“微生物的 ”之称。同其他生物环境相比，土壤中的微生物，数量最 ，种类最 。②土壤要求：富含 ，PH接近 且潮湿。③取样部位：距地表约 cm的土壤层。

（2）制务培养基 准备选择培养基，以 为唯一氮源制备9个平板培养基。

（3）样品稀释

①稀释原因：样品的 直接影响平板上生长的菌落数目；

②稀释标准：选用一定稀释范围的样品液进行培养，保证获得菌落数在 之间，便于计数；③稀释倍数：测定土壤中细菌的数量，一般选用 倍的稀释液进行平板培养；测定放线菌的数量，一般选用 倍稀释；测定真菌的数量，一般选用 倍稀释。

456（4）涂布平板 在上述培养基的9个平板底面，每三个一组分别用记号笔写上10、10、10倍的三种456稀释液，然后用三支1mL无菌吸管分别从10、10、10倍的三管土壤稀释液中吸取0.1mL对号放入已写好稀释度的平板中，用 在培养基表面轻轻地涂布均匀。

（5）培养与观察员 ①培养：不同种类的微生物，往往需要不同的培养 和培养时间；②观察：每隔24h统计一次菌落数目，最后选取 时的记录作为结果。

（6）计数

当菌落数目稳定时，取同一稀释度下的3个平板进行计数，求出 ，并根据所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。

2．操作提示

(1)无菌操作：①取土样的用具在使用前都需要 。

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②应在 旁称取土壤，并在火焰附近将称好的土样倒入锥形瓶中，塞好 。

③在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在 旁操作。

(2)做好标记：本实验使用的平板和试管比较多。为避免混淆，最好使用前就做好 。

(3)制定计划：对于耗时较长的生物实验，要事先规划 ，以便提高工作效率。

3．菌种鉴定

(1)原理：分解尿素的细菌合成的脲酶将尿素分解为 ，使培养基的 增强。

(2)方法：在以 为唯一氮源的培养基中加入 指示剂培养细菌，若指示剂变 ，可初步鉴定该种细菌能够分解尿素。

[思考]

1．为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？当第一次测定时为什么要将稀释的范围放宽一些？

2．为什么要选取菌落数目稳定时的记录作为结果？

[重难点]

1．分离分解尿素的细菌的实验设计原则

(1)设立重复组：统计某一稀释度下平板上的菌落数时，要至少涂布3个平板作 组，增强实验结果的 与准确性。

(2)设立两种对照组：

①判断培养基中是否有杂菌污染，需将 同时进行培养。

②判断选择培养基是否具有筛选作用，需设立 培养基进行接种后培养，观察两种培养基上菌落数目，进行对比得出结论。

2．实验结果分析

内容

现象

结论

对照的培养皿中 （有无）

菌落生长

有无杂菌污染的判断

培养基中菌落数 。

培养基中混入其

菌落形态多样，菌落数偏 。

他杂菌

选择培养

牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落选择培养基具有 作用

基的筛选作用

数目大于选择培养基上的数目

得到 菌落样品的稀释操作

操作成功

数目在30～300的平板

重复组的结果

若选取同一种土样，统计结果应接近

[提醒]

(1)稀释涂布平板法所选择倒平板的稀释度很重要，一般以3个稀释度中的第二个稀释度倒平板所出现的平均菌落数在 个左右的最好。

(2)在设计实验时，一定要涂布至少 个平板作为重复组。

(3)在分析结果时，一定要考虑所设置的重复组的结果是否一致，如果差别过大，则意味着操作有误，需要 。

命题点一 选择培养基的特点和应用

[例1] 下表是培养分解尿素的细编号

成分

含量

菌的培养基配方，请回答下面的问①

KH2PO4

1.4 g 题：(1)在该培养基的配方中，为微②

Na2HPO4

2.1 g 生物提供碳源的是________，提供③

MgSO4·7H2O 0.2 g 氮源的是________。

④

葡萄糖

10.0 g (2)绝大多数微生物都能利用⑤

1.0 g 尿素

________，但是，只有能合成脲酶⑥

琼脂

15.0 g 的微生物才能分解________。

将上述物质溶解后，用自来水定容到1 000 mL (3)分析该培养基的配方，该培养基对微生物是否具有选择作用？如果具有，又是如何进行选择的？

[归纳拓展]

(1)选择培养微生物的方法通常有两种：①可利用该分离对象对某一营养物质

3

有“嗜好”的原理，专门在培养基中加入 ，从而使它成为一种加富培养基。

②可利用该分离对象对某种抑菌物质的抗性，在混合培养物中加入 ，经培养后，其他微生物生长受抑制，而分离对象却可乘机大大增殖，在数量上占优势。

(2)原则上只有目的微生物才能在选择培养基上生长。但实际上，微生物培养是一个非常复杂的问题，有些微生物可以利用其他微生物的代谢产物生长繁殖，因此能够在选择培养基上生长的微生物 （一定或不一定）都是所需要的微生物，还需要进一步的验证。

跟踪训练

分离土壤中分解尿素的细菌，对培养基的要求是(

) ①加尿素

②不加尿素

③加琼脂

④不加琼脂

⑤加葡萄糖

⑥不加葡萄糖

⑦加硝酸盐

⑧不加硝酸盐

A．①③⑤⑦

B．②④⑥⑧ C．①③⑤⑧

D．①④⑥⑦

命题点二 以科研课题为载体，考查微生物的分离与计数

[例2]

自然界中的微生物往往是混杂生长的。人们在研究微生物时一般要将它们分离提纯，然后进行数量的测定。下面是对大肠杆菌进行数量测定的实验，请回答有关问题：

实验步骤：(1)制备稀释倍数为102、103、104、105、106的系列稀释液。

(2)选用______________法接种样品。

(3)适宜温度下培养。

结果分析：

(1)测定的大肠杆菌数，在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下几种统计结果，正确可信的是(

) A．一个平板，统计的菌落数是23 B．两个平板，统计的菌落数分别是22和26，取平均值24 C．三个平板，统计的菌落数分别是21、5和52，取平均值26 D．四个平板，统计的菌落数分别是21、30、24和25，取平均值25 (2)一同学在稀释倍数为106的培养基中测得平板上菌落数的平均值为23.4，那么每毫升样品中的菌株数是(涂布平板时所用稀释液的体积为0.2 mL)____________。

(3)用这种方法测定密度，实际活菌数量要比测得的数量________，因为_____________。

(4)某同学在测定大肠杆菌的密度时发现，在培养基上还有其他杂菌的菌落，能否肯定该大肠杆菌的品系被污染了？为什么？

[易错警示] 实验时，每一个浓度至少涂布 个平板，以增强实验的说服力

和 。当样品的稀释倍数足够高时，培养基表面生长的一个菌落来源于样品稀释液中的 。计数时选择菌落数在30～300的平板计数，若某两个或多个稀释浓度下获得的菌落数符合条件时，再看两者菌落数的比值：若小于2，则取 ；若大于2，则取小者。

[回扣练习] 1．在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基称做(

) A．鉴别培养基

B．加富培养基

C．选择培养基

D．基础培养基

2．下列关于从土壤中分离细菌的操作步骤的顺序，正确的是(

) ①土壤取样

②称取10 g土壤，加入盛有90 mL无菌水的锥形瓶中

③吸取0.1 mL进行平板涂布

④依次稀释至101、102、103、104、105、106、107稀释度

A．①→②→③→④

B．①→③→②→④

C．①→②→④→③

D．①→④→②→③

3．下列关于微生物分离和培养的有关叙述，错误的是(

) A．微生物培养前，需对培养基进行消毒B．测定土壤样品中的细菌数目，常用菌落计数法

C．分离土壤中不同的微生物，要采用不同的稀释度

D．分离能分解尿素的细菌，要以尿素作为培养基中唯一的氮源

4．用稀释涂布平板法来统计样品中的活菌数时，通过统计平板上的菌落数就能推测出样品中的活菌数，原因是(

) A．平板上的一个菌落就是一个细菌

B．菌落中的细菌数是固定的

C．此时的一个菌落一般来源于样品稀释液中的一个活菌

D．此方法统计的菌落数一定与活菌的实际数相同

5．苯酚是工业生产排放的有毒污染物质，自然界中存在着能降解苯酚的微生物。某工厂产

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生的废水中含有苯酚，为了降解废水中的苯酚，研究人员从土壤中筛选获得了只能降解利用苯酚的细菌菌株，筛选的主要步骤如下图所示，其中①为土壤样品。请据图回答下列问题：

(1)②中的培养基中应加入________作为碳源；如要测定②中活菌数量，常采用________法。

(2)④为对照，微生物在④中不生长，在⑤中生长，④与⑤培养基的主要区别为_________；使用________法可以在⑥上获得单菌落。采用固体平板培养细菌时为什么要进行倒置培养？______________________________________________________________________________。

(3)请设计一个简单实验，比较不同菌株降解苯酚能力的大小。__________________ ________________________________________________________________________。

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