课题3　血红蛋白的提取和分离多媒体教案及点评

血红蛋白的提取与分离

一、本课题学习目标：

体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法，并了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。

1、主要概念：①凝胶色谱法

②电泳法

③缓冲溶液

④它们在血红蛋白的提取中分别起到什么作用。

2.主要原理：①凝胶色谱法分离蛋白质的原理

②电泳法分离样品的原理

③缓冲溶液的组成和作用机理

3、课题重点：凝胶色谱法的原理和方法 4、课题难点：①样品的预处理

②色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。

二、血红蛋白的提取和分离

1.分离选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。生物大分子的基本思路：

2.蛋白质分离和提取的原理：

根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同种类的蛋白质。

3.高温灭菌使微生物的蛋白质发生变性、蛋白质的空间结构被破坏。和酒精灭菌的结果：

三、缓冲溶液

在一定的范围内，凡是能够抵制外加少量强酸或强碱的影响使原来溶液PH值基本保持不变的混合溶液。能够抵制外界的酸和碱对溶液PH值的影响，维持PH基本不变。 通常由1－2 种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同PH范围内使用的缓冲液。

在本课题中使用的缓冲液是:__________ ,其目的是利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证

血红蛋白的正常结构和功能，便于观察(红色)和科

学研究(活性) 三、

电泳：

带电粒子在电场作用下发生迁移的过程

①许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团会带上正电或负电。②在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。③电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。

琼脂糖凝胶电泳、聚丙稀酰胺凝胶电泳。

SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是单条肽链的分子量。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。

①凝胶的选择：A、材料：交联葡聚糖凝胶（G-75）。B、代表意义：“G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围。75表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5克。

②凝胶的前处理：配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。

③凝胶色谱柱的装填方法：A、固定：将色谱柱装置固定在支架上。B、装填：将凝胶悬浮液一次性的装填入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。注意：1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。 2、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。

①调节缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。

②滴加透析样品：吸管吸1ml样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。

③样品渗入凝胶床：加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。

④洗脱：小心加入pH=7.0 的20mmol/l的磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。

⑤收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5ml收集一试管，连续收集。（在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）

⑥注意：正确的加样操作：1、不要触及并破坏凝胶面。2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。

1.凝胶色谱法分离蛋白质的的原理是怎样的? 2.什么是缓冲溶液?它的作用是什么? 3.电泳的作用及其原理是什么? 4.你能描述血红蛋白分离的完整过程吗? 5.与其他真核细胞相比,红细胞有什么特点?这一特点对你进行

蛋白质的分离有什么意义? 1.凝胶色谱法分离蛋白质的的原理是怎样的? 2.什么是缓冲溶液?它的作用是什么? 3.电泳的作用及其原理是什么? 4.你能描述血红蛋白分离的完整过程吗? 5.与其他真核细胞相比,红细胞有什么特点?这一特点对你进行

蛋白质的分离有什么意义?