课题3　血红蛋白的提取和分离教学设计(教案)

课题3 血红蛋白的提取和分离

一、蛋白质提取与分离的原理和方法

1．蛋白质分离的原理

根据蛋白质各种特性的差异分离蛋白质，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等等。

2．凝胶色谱法

(1)概念：也称做分配色谱法，是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。

(2)原理

相对分子质量容易进入路程较长→→较小的蛋白质凝胶内部速度较慢相对分子质量不同的蛋白质

相对分子质量在凝胶外路程较短，分子得以分离→→较大的蛋白质部移动速度较快3．缓冲溶液

(1)作用：在一定范围内，缓冲溶液能抵制外界的酸和碱对溶液pH的影响，维持

pH基本不变。

(2)配制：通常由1～2种缓冲剂溶解于水中配制而成，调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同pH范围内使用的缓冲液。

4．电泳

(1)概念：带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。

(2)原理：

电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。

二、血红蛋白提取和分离的实验操作

蛋白质的提取和分离一般分为四步：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。

1.样品处理

红细胞的洗涤→血红蛋白的释放→分离血红蛋白溶液

2．粗分离——透析

去除样品中相对分子质量较小的杂质。

3．纯化——凝胶色谱操作

凝胶色谱柱的制作→凝胶色谱柱的装填→样品的加入和洗脱

4．纯度鉴定

鉴定方法中使用最多的是

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。

1．凝胶色谱法的原理和方法是什么？

2．缓冲液的制备及作用是什么？

3．蛋白质纯度鉴定的方法——电泳法的原理是什么？

4．提取和分离血液中血红蛋白的基本过程和方法是什么？

探究点一

[共研探究]

生物体内的蛋白质多种多样，根据不同蛋白质分子之间特性的差异常使用凝胶色谱法和电泳法进行分离。

1．凝胶色谱法

蛋白质提取与分离的原理和方法

根据上图，分析凝胶色谱法分离蛋白质的原理(填表)：

运动路径

运动方式

运动路程

运动速度

洗脱次序

相对分子质量大

凝胶外部

垂直向下运动

较短

较快

先流出

相对分子质量小

凝胶内部

无规则的扩散运动

较长

较慢

后流出

2.电泳

(1)原理

①许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团会带上正电或负电。

②在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。

③电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。

(2)常用方法

①琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖本身不带电荷，由于各种分子带电性质的差异、分子大小和形状的不同，在电场中迁移速度不同，从而得以分离。

②聚丙烯酰胺凝胶电泳

在测定蛋白质分子量时通常使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。SDS能使蛋白质发生完全变性，解聚成单条肽链，因此用该方法测定的结果只是单条肽链的分子量。

SDS能与各种蛋白质结合形成蛋白质-SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。

[总结升华]

凝胶色谱法和电泳法的比较

分离依据

分离动力

分子大小的影响

[对点演练]

1．使用凝胶色谱法分离蛋白质实验中，相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中的行进过程，可表示为(

) 2．下列关于电泳的叙述，错误的是(

) A．电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程

B．带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动

C．蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少

D．用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质，蛋白质的电泳迁移率完全取决于分子的大小

探究点二

[共研探究]

每一种蛋白质的分离纯化方法因其来源和性质不同会有很大差异，下面以哺乳动物红细胞为材料，学习初步分离血红蛋白的方法。

1．样品处理

(1)红细胞的洗涤

①目的：去除杂蛋白，以利于后续步骤的分离纯化。

②过程：低速短时间离心→吸出上层透明的黄色血浆→下层红细胞液体倒入烧杯→加五倍体积生理盐水→缓慢搅拌10 min→低速短时间离心→重复洗涤三次，直至上清液中没有黄色(表明红细胞已洗涤干净)。

(2)血红蛋白的释放

①目的：使红细胞破裂，释放出血红蛋白。

②过程

(3)分离血红蛋白溶液

①目的：经过离心使血红蛋白与其他杂质分离开来，便于下一步对血红蛋白的纯化。

②过程

2 000 r/min滤纸混合液―→离心管――→溶液分层――→

除去脂溶性沉淀层―→分液漏斗静置,分出下层的红色透明液体(血红蛋白溶液) 10 min过滤③结果(填表) 血红蛋白提取和分离的实验操作

凝胶色谱法

相对分子质量大小

重力

相对分子质量大，移动速度快

电泳法

分子带电性质差异、分子大小和形状等

电场力

分子大，阻力大，移动速度慢

2．粗分离——透析

(1)目的：除去样品中相对分子质量较小的杂质或用于更换样品的缓冲液。

(2)原理：透析袋能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋内。

装入放入(3)操作：1 mL血红蛋白溶液――→透析袋――→300 mL物质的量浓度为20 mmol/L的磷酸缓冲液中(pH为7.0)―→透析12 h。

3．纯化——凝胶色谱操作

(1)凝胶色谱柱的制作

①取长40 cm，内径为1.6 cm的玻璃管，两端用砂纸磨平。

②柱底部制作：橡皮塞打孔→挖出凹穴→安装移液管头部→覆盖尼龙网，再用100目的尼龙纱将橡皮塞上部包好。

③柱顶部制作：橡皮塞打孔→安装玻璃管。

④将上述三部分按相应位置组装成一个整体。

⑤安装其他附属结构。

(2)凝胶色谱柱的装填

(3)样品的加入和洗脱

4．纯度鉴定

判断纯化的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质纯度的鉴定。鉴定的方法中，使用最多的是SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。

[总结升华]

1．实验中各步骤操作的目的

操作步骤

红细胞的洗涤

血红蛋白的释放

分离血红蛋白溶液

透析

纯化

2.实验结果分析与评价

目的

去除杂蛋白，如血浆蛋白

使红细胞破裂，释放血红蛋白

经过离心使血红蛋白与其他杂质分离开

除去样品中相对分子质量较小的杂质

除去相对分子质量较大的蛋白质

项目

①分层明显→样品处理完成

血液样品的处理

分析

②分层a.洗涤次数少，未能除去血浆蛋白不明显b.离心速度过快和时间过长使白细胞的原因

等一同沉淀，达不到分离效果

凝胶色谱柱的装填

①放一支与凝胶柱垂直的日光灯直接检查凝胶是否装填得均匀

②加入大分子有色物质如蓝色葡聚糖2 000或红色葡聚糖，若色带均匀、狭窄、平整→装填成功

①血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随洗脱液缓慢流出→分离成功

②血红蛋白的红色区带歪曲、散乱、变宽→分离效果不好，可能与凝胶色谱柱的装填有关

血红蛋白的分离

3.实验操作中的注意事项

(1)实验材料选用哺乳动物或人的成熟红细胞，原因是哺乳动物或人的成熟红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富，便于提取血红蛋白。血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。

(2)洗涤红细胞不能用蒸馏水代替生理盐水，因为生理盐水能保持红细胞的渗透压稳定，如果改用蒸馏水会使红细胞吸水胀破。

(3)释放血红蛋白的操作中加入蒸馏水的作用是使红细胞吸水胀破，加入甲苯的作用是溶解细胞膜，加速红细胞的破裂。

(4)在色谱柱中装填凝胶的时候要尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。一是在装填凝胶柱时，不得有气泡存在，因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，影响分离效果；二是在凝胶色谱操作过程中，不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。一旦发生上述两种情况，凝胶色谱柱需要重新装填。

[对点演练]

3．下列是有关血红蛋白提取和分离的相关操作，其中错误的是(

) A．血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液

B．用生理盐水重复洗涤红细胞

C．血红蛋白释放后应低速短时间离心

D．不断用磷酸缓冲液处理的目的是让血红蛋白处在稳定的pH范围内，以维持其结构和功能

1．利用凝胶色谱法分离蛋白质的原理是(

) A．蛋白质分子与凝胶的亲和力的大小

B．蛋白质相对分子质量的大小

C．蛋白质所带电荷的多少

D．蛋白质溶解度的大小

2．下列是有关血红蛋白的提取和分离的相关操作，其中正确的是(

) A．可采集猪血作为实验材料

B．用蒸馏水重复洗涤红细胞

C．血红蛋白释放后，应以200 r/min速度离心1 min

D．洗脱液接近色谱柱底端时开始收集流出液

3．下列关于蛋白质的提取与分离的叙述正确的是(

) A．在凝胶色谱柱内，相对分子质量较大的蛋白质路程较长，但移动速度较快

B．从凝胶色谱柱中最后分离出来的是相对分子质量较小的蛋白质

C．蛋白质的纯化使用最多的方法是SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法

D．分离血红蛋白溶液时，离心管的第三层是脂类物质

4．红细胞中含有大量血红蛋白，可以选用猪、牛、羊或其他哺乳动物的血液进行实验来提取和分离血红蛋白。如图为血红蛋白的提取和分离流程图。请回答下列问题：

(1)将实验流程补充完整：A为________________，B为________________。凝胶色谱法是根据________________________分离蛋白质的有效方法。

(2)红细胞洗涤时洗涤次数不能过少，否则____________________；离心速度过高和____________会使白细胞等一同沉淀，达不到分离的效果。

(3)为了加速膨胀，可以将加入洗脱液的湿凝胶用______法进行加热，这种方法不但节约时间，而且能除去凝胶中可能带有的微生物，排出胶粒内的________。

(4)如果红色区带________________，说明色谱柱制作成功。

【基础题组】

1．下列有关凝胶色谱法的叙述，错误的是(

) A．凝胶色谱法是根据相对分子质量大小分离蛋白质的有效方法

B．目前经常使用的凝胶有交联葡聚糖、聚丙烯酰胺和琼脂糖等

C．大分子物质后被洗脱出来，小分子物质先被洗脱出来

D．凝胶色谱法的原理是不同大小的分子所经的路径不同而得以分离

2．下列有关缓冲溶液的说法，错误的是(

) A．缓冲溶液能够抵制外界任何酸和碱对溶液pH的影响，维持pH基本不变

B．缓冲溶液通常由1～2种缓冲剂溶解于水中配制而成

C．调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同pH范围内使用的缓冲溶液

D．生物体内的各种生物化学反应都是在一定的pH下进行的

3．(2018·福建名校月考)下列有关提取和分离血红蛋白的叙述，错误的是(

) A．样品的处理就是通过一系列操作收集血红蛋白溶液的过程

B．通过透析可以去除样品中分子质量较大的杂质，此为样品的粗分离

C．可通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去，即样品的纯化

D．可通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白的纯度

4．下列有关凝胶色谱操作的叙述，错误的是(

) A．干的凝胶要用蒸馏水充分溶胀后，才能装填

B．在装填凝胶色谱柱时，不得有气泡产生

C．在装填凝胶色谱柱时，下端的尼龙管先打开后关闭

D．在样品洗脱过程中，不能让洗脱液流干

5．下列关于血红蛋白提取和分离的过程及原理的叙述，正确的是(

) A．为了防止血液凝固，应在采血器中预先加入抗凝血剂柠檬酸钠

B．红细胞洗涤使用5倍体积的蒸馏水，直到离心后上清液不呈现黄色

C．利用质量分数为0.9%的NaCl溶液对血红蛋白溶液透析12 h，可以去除小分子杂质

D．在凝胶色谱柱中加入蛋白质样品后即可连接缓冲液洗脱瓶进行洗脱和收集样品

6．在蛋白质的提取和分离中，对于样品的处理过程的分析正确的是(

) A．洗涤红细胞的目的是除去血浆中的葡萄糖、无机盐

B．洗涤时离心速度过慢，时间过短，白细胞等会沉淀，达不到分离的效果

C．洗涤过程选用质量分数为0.1%的NaCl溶液

D．透析的目的是去除样品中相对分子质量较小的杂质

7．下列说法错误的是(

) A．血红蛋白释放时，加蒸馏水到原血液的体积，再加40%体积的甲苯，充分搅拌10 min，红细胞破裂释放出血红蛋白

B．血红蛋白溶液离心后分为4层，第一层为白色薄层固体

C．血红蛋白溶液离心后分为4层，第四层为暗红色沉淀物

D．血红蛋白溶液离心后分为4层，第三层为红色透明层

8．对在凝胶柱上加入样品和洗脱的操作，错误的是(

) A．加样前要使柱内凝胶面上的缓冲液下降到与凝胶面平齐

B．让吸管管口沿管壁环绕移动，贴壁加样至色谱柱顶端，不要破坏凝胶面

C．打开下端出口，待样品完全进入凝胶层后，直接连接缓冲液洗脱瓶，开始洗脱

D．待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，每5 mL收集一管，连续收集流出液

【能力题组】

9．蛋白质的分离与纯化技术是蛋白质研究的重要技术。下列有关叙述错误的是(

) A．根据蛋白质分子不能透过半透膜的特性，可将样品中各种不同的蛋白质分离

B．根据蛋白质所带电荷性质的差异及分子大小等，可通过电泳分离蛋白质

C．根据蛋白质相对分子质量的大小，可通过凝胶色谱法分离蛋白质

D．根据蛋白质的分子大小、密度不同，可通过离心沉降法分离蛋白质

10．以下关于猪血红蛋白提纯的描述，错误的是(

) A．洗涤红细胞时，使用生理盐水可以防止红细胞破裂

B．猪成熟红细胞中缺少细胞器和细胞核，提纯时杂蛋白较少

C．血红蛋白的颜色可用于凝胶色谱法分离过程的监测

D．在凝胶色谱法分离过程中，血红蛋白比分子质量较小的杂蛋白移动慢

11．下列关于血红蛋白提取和分离实验中样品处理步骤的描述，正确的是(

) A．红细胞的洗涤：加入蒸馏水，缓慢搅拌，低速短时间离心

B．血红蛋白的释放：加入生理盐水和甲苯，置于磁力搅拌器上充分搅拌

C．分离血红蛋白溶液：将搅拌好的混合液离心、过滤后，用分液漏斗分离

D．透析：将血红蛋白溶液装入透析袋，然后置于pH为4.0的磷酸缓冲液中透析12 h 12．已知某样品中存在甲、乙、丙、丁、戊五种物质，其分子大小、电荷的性质和数量情况如图所示。下列叙述正确的是(

A．将样品装入透析袋中透析12 h，若分子乙保留在袋内，则分子甲也保留在袋内

B．若五种物质为蛋白质，则用凝胶色谱柱分离时，甲的移动速度最快

C．将样品以2 000 r/min的速度离心10 min，若分子戊存在于沉淀中，则分子丙也存在于沉淀中

)

D．若五种物质为蛋白质，用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离样品中的蛋白质分子，则分子甲和分子戊形成的电泳带相距最近

13．如图为血红蛋白的提取和分离的部分实验装置，请回答下列问题：

(1)血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分，其在红细胞中的作用体现了蛋白质具有____________________________________________________________功能。

(2)甲装置中，B是血红蛋白溶液，则A是___________________________________ ___________________________________________；

乙装置中，C溶液的作用是_______________________________________________ ___________________________________________。

(3)用乙装置分离蛋白质的方法称为________________________________________________________________________，是根据

________________________________________________________________________分离蛋白质的有效方法。

(4)用乙装置分离血红蛋白时，待________________________________________________________________________ 时，用试管收集流出液，每5 mL收集一管，连续收集。

(5)血红蛋白提取和分离的程序可分为四步：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。其中样品处理包括__________________、________________________________________________________________________、分离血红蛋白溶液。

14．下图表示血红蛋白提取和分离实验的部分装置或操作方法，请回答下列问题：

(1)图甲表示________过程，该操作目的是去除样品中______________________的杂质。现有一定量的血红蛋白溶液，进行上述操作时若要尽快达到理想的实验效果，可以____________________________________________________(写出一种方法)。

(2)如图乙，向凝胶色谱柱中加样的正确操作顺序是________(用序号表示)。在进行④操作前，应该等样品________________，且要________(填“打开”或“关闭”)下端出口。

(3)如图丙，a、b均为蛋白质分子，其中先从凝胶色谱柱中洗脱出来的是__________，原因是

________________________________________________________________________。

15．随着人类基因组计划和多种生物基因组测序工作的完成，人类跨入了后基因组和蛋白质组时代。对蛋白质进行研究时，首先要获得纯度较高的蛋白质。下图是某生物兴趣小组在“蛋白质的提取和分离”实验中，准备从猪的血液中初步提取血红蛋白，设计的“血红蛋白提取、分离流程图”：

请回答下列有关问题：

(1)样品处理中红细胞的洗涤要用________反复冲洗、离心。向红细胞悬液中加入一定量的低浓度pH 7.0的缓冲液并充分搅拌，可以破碎红细胞，破碎细胞的原理是________。

(2)血红蛋白的纯化是通过______________法将相对分子质量大的杂质蛋白除去。

(3)电泳利用了待分离样品中各种分子的________________________________等的差异，而产生不同迁移速度，实现各种分子的分离。

(4)一同学通过血红蛋白醋酸纤维薄膜电泳，观察到正常人和镰刀型细胞贫血症患者的血红蛋白电泳结果如图所示。

由图可知携带者有________种血红蛋白，从分子遗传学的角度作出的解释是____________________________________________ ________________________________。