课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数名师教学实录

课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

学习目标

1.通过阅读教材P21～22“能利用选择培养基分离细菌。”

2.结合教材P22～26能运用活菌计数法测定土壤中分解尿素细菌的数量

【预习案】

一、研究思路

1.筛选菌株

(1)PCR技术要用到一种关键酶——

得。

(2)微生物筛选的原理是：人为提供有利于

生长的条件(包括 、

、 ，这种酶只能在耐

环境的微生物中获pH等)，同时

或阻止其他微生物的生长，该类培养基是 。

2.(1)在稀释涂布平板法和平板划线法两种方法中，

适合统计样品中活菌的数目。该方法要求对样品的稀释度要

，确保一个菌落来源于 。

(2)用于活菌计数的平板要形成 个菌落。所统计的菌落数往往比活菌的实际数值要 ，原因是

连在一起时观察到的仅是一个菌落。

对实验结果的影响，提高实验结果的3.设置对照：目的是排除实验组中

。

二、实验设计

1.操作步骤：土壤取样→ 2.土壤取样一般要铲去

→微生物的

。

，因为绝大多数细菌分布于距地表约 的土壤层。

3.样品的稀释：不同的微生物需要稀释的倍数不同，请填写下表

微生物

细菌

放线菌

真菌

4.微生物的培养与观察

微生物的生长受 的影响，菌落的数目和 是观察的主要内容。

三、操作提示

1.无菌操作：取土样用的

和盛土样的

在使用前都需要灭菌。称取土样稀释倍数

1

要在 旁进行。稀释样品要在 旁操作。

2.做好标记：要对

和试管进行标记，尤其进行系列稀释时要按

顺序将试管排列成行。

四、课题延伸

分解尿素的细菌合成的 将尿素分解成了氨，使培养基的碱性增强。在以 为唯一氮源的培养基中加入

指示剂培养细菌，若指示剂变 ，可以初步鉴定该种细菌能够分解

。

（一）、选择培养基

1.选择培养基的制作方法

(1)在培养基全部营养成分具备的前提下，依据某些微生物对某些物质的抗性，在培养基中加入某些物质，以抑制不需要的微生物，促进所需要的微生物生长，如培养基中加入高浓度食盐时可抑制多种细菌的生长，但不影响金黄色葡萄球菌的生长，从而可将该菌分离出来；而在培养基中加入青霉素时可抑制细菌、放线菌的生长，从而分离得到酵母菌和霉菌等。

(2)通过改变培养基的营养成分达到分离微生物的目的：培养基中缺乏氮源时，可分离自生固氮微生物，非自生固氮微生物因缺乏氮源而无法生存；培养基中若缺乏有机碳源则异养微生物无法生存，而自养微生物可利用空气中的CO2制造有机物生存。

(3)利用培养基的特定化学成分分离特定微生物：如当石油是唯一碳源时，可抑制不能利用石油的微生物的生长，使能够利用石油的微生物生存，从而分离出能消除石油污染的微生物。

(4)通过某些特殊环境分离微生物：如在高盐环境中可分离耐盐菌，其他菌在盐浓度高时易失水而不能生存；在高温环境中可分离得到耐高温的微生物，其他微生物在高温环境中因酶失活而无法生存。

2.结果分析与评价

内容

现象

对照的培养皿中无菌落生长

有无杂菌污染的判断

对照的培养皿中有菌落生长

被杂菌污染

选择培养基的筛选作牛肉膏培养基上的菌落数目大于选择选择培养基具有筛选作用

样品的稀释操作

重复组的结果

应用示例

1.苯酚是工业生产排放的有毒污染物质，自然界中存在着降解苯酚的微生物。某工厂产生的废水中含有苯酚，为了降解废水中的苯酚，研究人员从土壤中筛选获得了只能降解利用苯酚的细菌菌株，筛选的主要步骤如图所示，①为土壤样品。请回答下列问题。

2 结论

未被杂菌污染

培养基上的数目

得到两个或两个以上菌落数目在30～300的平板

用

操作成功

若选取同一种土样，统计结果应接近

(1)②中培养目的菌株的选择培养基中应加入 作为唯一碳源，②中不同浓度碳源的培养基 (A.影响；B.不影响)细菌的数量，如果要测定②中活细菌数量，常采用 法。

(2)④为对照，微生物在④中不生长，在⑤中生长，④与⑤培养基的主要区别在于 ；

使用 法可以在⑥上获得单菌落。采用固体平板培养细菌时进行倒置培养的原因是 。

(3)实验过程中如何防止其他微生物的污染？

。

答案

(1)苯酚

A 稀释涂布平板

(2)④的培养基没有加入苯酚作为碳源，⑤的培养基加入苯酚作为碳源

稀释涂布平板法或平板划线

以防止冷凝后形成的水珠滴落在培养基上污染培养基

(3)培养基灭菌，接种环境灭菌，接种过程无菌操作

一题多变 (1)为什么测定活菌的数量不能用平板划线法？

答案

由于在所划的线中，只有最后一次划线的末端才会形成由一个细菌形成的菌落，而其他一些菌落往往由两个细菌或多个细菌繁殖而成，而在计数时一个菌落对应着一个细菌，这样在划线所得的平板中，菌落数目低于活菌的实际数值，所以不能用平板划线法测定活菌数量。

(2)如何判断培养基是否被污染？

答案

在不接种微生物的情况下将培养基在培养箱中进行培养，如果培养基中无菌落出现，则说明没有被污染，如果有菌落出现，则说明培养基被污染。

(3)两位同学在取土壤样品时，一位同学在不含苯酚的土壤中取样，另一位同学在含苯酚的土壤中取样，哪位同学做得较好？

答案

在含有苯酚的土壤中取样较好。

二、统计菌落的数目

1.显微镜直接计数法(总菌计数法) (1)原理：此法利用特定细菌计数板或血球计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量。

(2)方法：用计数板计数。计数板是一块特制的载玻片，上面有一个特定的面积为1 mm2和高为0.1 mm的计数室，在1 mm2的面积里又被划分成25个(或16个)中格，每个中格进一步划分成16个(或25个)小格，但计数室都是由400个小格组成的，如图所示。

3

(3)计算公式：每毫升原液所含细菌数＝每小格平均细菌数×400×10 000×稀释倍数

(4)缺点：不能区分细菌的死活。

2.间接计数法(活菌计数法) (1)原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。

(2)计算公式：每克样品中的菌株数＝(C÷V)×M。其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用稀释液的体积(mL)，M代表稀释倍数。

(3)统计方法：统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好能统计3个平板，计算出平板上菌落数的平均值，然后按公式进行计算。

【小结提升】

【典题训练】

1.可以分离并鉴定出分解尿素的细菌的方法是(

) A.以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂

B.以尿素为唯一氮源的培养基中加入二苯胺试剂

C.以尿素为唯一氮源的培养基中加入刚果红试剂

D.以尿素为唯一氮源的培养基中加入双缩脲试剂

2.选择培养基是根据某一种或某一类微生物的特殊营养要求或对一些物理、化学抗性而设计的培养基。利用这种培养基可以将所需要的微生物从混杂的微生物中分离出来。为选择酵母菌和硝化细菌，应选用的培养基分别为(

) A.伊红美蓝培养基、含青霉素培养基 B.含青霉素培养基、含氨的无机培养基

C.含氨的无机培养基、含青霉素培养基 D.含青霉素培养基、伊红美蓝培养基

4

3.下列说法错误的是(

) A.因为土壤中各类微生物的数量不同，所以为获得不同类型的微

生物，要按不同的稀释倍数进行分离

B.测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，

选用的稀释范围不同

C.只有得到了3个或3个以上菌落数目在30～300的平板，才说明

稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数

D.牛肉膏蛋白胨培养基的菌落数明显大于选择培养基的数目，说

明选择培养基已筛选出一些细菌菌落

4.某同学要分离土壤中能分解尿素的细菌，并统计每克土壤样品中的活菌数目，培养基配方如下表：

KH2PO4 1.4 g

(1)根据培养基的成分判断，该同学能否分离出土壤中分解尿素的细菌？ (能/不能)，原因是 。

(2)该培养基为 培养基(按物理状态分)，因为培养基中含有 。

(3)要统计每克土壤样品中活菌数目，宜采用 法。根据土壤样品的稀释倍数和接种稀释液的体积，统计平板上的 就能大约推测出样品中的活菌数。

(4)如果把该培养基中的蛋白胨去掉，培养基上的微生物是不是一定都是能分解尿素的细菌？ 。为什么？ 。

答案

(1)不能

培养基含蛋白胨，尿素不是唯一氮源，不能选择出只以尿素为氮源的微生物

(2)固体

凝固剂琼脂

(3)稀释涂布平板

菌落数目

(4)不一定

因为有些微生物可以利用尿素分解菌的含氮代谢产物进行生长繁殖

Na2HPO4 2.1 g MgSO4·7H2O

0.2 g 蛋白胨

1.0 g 葡萄糖

10.0 g 尿素

琼脂

1.0 g 15.0 g

5