复习与测试教案3

课题5.3 血红蛋白的提取和分离

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【学习目标】：本课题尝试对血液中血红蛋白的提取和分离，使学生能够体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法，并了解色谱法，电泳法等分离生物大分子的基本原理，为今后学习运用这些技术打下基础。

【学习重点】：凝胶色谱法的原理和方法

【学习难点】：样品的预处理；色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。

【自主学习】

一、凝胶色谱法

1、概念：也称做

；是根据

分离蛋白质的有效方法。

2、原理

（1）由

构成的凝胶，内部有许多贯穿的的

。

（2）当

不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量

的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程

，移动速度

，而相对分子质量

的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在

移动，路程

，移动速度

，从而使

不同的蛋白质分子得以分离。

二、缓冲溶液

1、作用：在一定范围内，抵制

的

对溶液pH的影响，维持pH

。

2、配制：由

种缓冲剂溶解于

中配制而成，通过调节缓冲剂的

就可以得到不同pH范围内使用的缓冲液。

三、电泳

1、概念：指

在电厂的作用下发生

的过程。

2、原理：在一定的

下，

、

等生物大分子的可解离基团会带上

或

，在

的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷

的电极移动。

3、作用：电泳利用了待分离样品中各种分子

的差异及分子本身的

、

的不同，使带电分子产生不同的

，从而实现样品中

的分离。

4、方法：常用的电泳方法有

和

。测定蛋白质分子量时通常使用

。

四、实验操作

1、样品处理:通过

、

、

等操作收集血红蛋白溶液。

(1)红细胞的洗涤：目的是

。分离时采取

，直至上清液中没

1

有

，表明红细胞已洗涤干净。

(2)血红蛋白的释放：在

和

的作用下，红细胞破裂，释放出血红蛋白。

(3)分离血红蛋白溶液：把

离心后，将试管中的液体用

过滤、除去

，于

中静置片刻后，分离出下层的

。

2、粗分离：即透析

(1)方法：将血红蛋白溶液装入

，将

放入一定量适宜浓度的

中，透析

。

(2)目的：将

的杂质除去。

(3)原理：透析袋能使小分子自由进出，而将大分子物质保留在袋内。

3、纯化:通过凝胶色谱柱将相对分子质量较大的杂质蛋白除去。操作如下：

(1)凝胶色谱柱的制作。

(2)凝胶色谱柱的装填

①材料：本实验使用的是

。

②方法：凝胶用

充分溶胀后。配成

，一次性

倒人色谱柱内。不能有

存在；不能发生

流干露出凝胶颗粒的现象。

(3)样品的加入和洗脱

①a、准备：加样前，打开流出口，使柱内凝胶面上的

缓慢下降到与

平齐，关闭出口。

b、加样：用

小心地将1mL透析后的样品加到

的顶端，注意不要破坏

。

c、加样后：打开下端出口，使样品渗入

内。

②洗脱：加入

，打开下端出口，进行

。

4、纯度鉴定：在鉴定的方法中，使用最多的是

。五、操作提示

1、红细胞的洗涤：

、

与

十分重要。

过少，无法除去血浆蛋白；

过高和

过长会使

等一同沉淀，达不到分离效果。

2、色谱柱填料的处理：商品凝胶使用前需直接放在

中膨胀，可以将加入其中的

用

加热，加速膨胀。

3、凝胶色谱柱的装填：在装填凝胶柱时，不得有气泡存在。气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的

，降低

。

4、蛋白质的分离：如果红色区带

地移动，说明色谱柱制作成功。

2

【基础训练】

一、选择题

1、凝胶色谱分离法分离蛋白质时，凝胶的种类较多，但其作用的共同点是

(

) A、改变蛋白质分子通过凝胶时的路径

B、吸附一部分蛋白质，从而影响蛋白质分子的移动速度

C、将酶或纽胞固定在凝胶中

D、与蛋白质分子进行化学反应，从而影响其移动速度

2、下列各项中，一般不影响凝胶色谱法分离蛋白质中的分离度的是

(

) A、层析柱高

B、层析柱的直径

C、缓冲溶液

D、样品的分布

3、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中决定蛋白质或多肽移动速度的主要因素是

(

) A、蛋白质分子所带的电荷

B、蛋白质分子的形状

C、蛋白质分子的相对分子质量

D、缓冲溶液的pH 4、为了提取血红蛋白，从学校附近的屠宰场索取新鲜的猪血，对猪血处理的正确操作是

A、要在采血容器中预先加人抗凝血剂柠檬酸钠

B、取血回来后，马上进行高速长时问离心

C、将离心后的血细胞加入清水缓慢搅拌

D、重复洗涤直到上清液呈红色为止

5、下面说法不正确的是

(

)

A、在一定范围内，缓冲溶液能够抵制外界的酸和碱对溶液pH的影响，维持pH基本不变

B、缓冲溶液通常由1～2种缓冲剂溶解于水中配制而成

C、电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程

D、透析袋能使大分子自由进出，而将小分子保留在袋内

6、蛋白质的提取和分离分为哪几步

(

)

A、样品处理、凝胶色谱操作、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

B、样品处理、凝胶色谱操作、纯化

C、样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定

D、样品处理、纯化、粗分离、纯度鉴定

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7、洗涤红细胞时，离心所采用的方法是

A、低速长时间离心

B、低速短时间离心

C、高速长时间离心

D、高速短时间离心

8、凝胶色谱法分离蛋白质中使用的凝胶是交联葡聚糖凝胶(Sephadex G一75)，其中G、75的含义为

(

) A、G表示凝胶的使用量，75表示加25 g水

B、G表示凝胶的交联程度，75表示需加热到75℃

C、G表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围，75表示每克凝胶膨胀时吸水7、5g D、G表示凝胶的膨胀体积,75表示每克凝胶膨胀时体积可达75cm3 【课后巩固】二、非选择题

1、凝胶色谱技术是一种快速而又简单的分离技术，由于设备简单、操作方便，不需要有机溶剂，对高分子物质有很高的分离效果，目前已经被生物化学、分子生物学、生物工程学、分子免疫学以及医学等有关领域广泛应用，不但应用于科学实验研究，而且，已经大规模地用于工业生产。据图回答问题：

（1）a、b均为蛋白质分子，其中先从层析柱中洗脱出来的是

，原因是

。

（2）自己制作凝胶色谱柱时，在色谱柱底部d位置相当于多孔板的结构可由

替代。

（3）装填凝胶色谱柱时，色谱柱内不能有气泡存在，原因是

。

（4）洗脱用的液体应尽量与浸泡凝胶所用的液体

(填“相同”或“不同”)，洗脱时，对洗脱液的流速要求是

。

2、蛋白质分子中，氨基酸的α-氨基和α-羧基虽然大部分结合成为肽键，但是蛋白质分子内仍含有各种酸性基团和碱性基团，如肽链末端的α-氨基和α-羧基、天冬氨酸和谷氨酸残基中的羧基、赖氨酸和组氨酸残基中的各种碱性基团，所以蛋白质是两性电解质。在酸性溶液中，碱性基团的解离增大，使蛋白质带正电荷；在碱性溶液中酸性基团的解离加强，使蛋白质带负电荷。当溶液到达某一pH时，蛋白质可因内部酸性和碱性基团的解离相等而呈等电状态，这时的溶液pH叫做蛋白质的等电点。不处于等电点状态的蛋白质分子的正、负电荷量是不相同的。试回答下列问题：

(1)多数蛋白质的等电点近于5，一般含碱性基团较多的蛋白质的等电点

(“偏高”还是“偏低”)。

(2)根据等电点的不同，你能用

方法将不同种类的蛋白质分子分开。

【学习感悟】

4

5.3基础训练

1---8 ACCADCBC 【课后巩固】

【1、思路点拨】用凝胶色谱技术分离各种大分子物质时，大分子物质先洗脱出来，然后是小分子物质。大分子物质由于直径较大，不易进入凝胶颗粒的微孔，而只能分布于颗粒之间，所以向下移动的速度较快。小分子物质除了可在凝胶颗粒间隙中扩散外，还可以进入凝胶颗粒的微孔，即进入凝胶相内，在向下移动的过程中，从一个凝胶颗粒内扩散到颗粒间隙后再进入另一凝胶颗粒，如此不断地进入和扩散，小分子物质的下移速度落后于大分子物质从而落后于大分子物质洗脱出来。在色谱柱中装填凝胶的时候要尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。一是在装填凝胶柱时，不得有气泡存在，因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。二是凝胶色谱操作过程中，不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。一旦发生上述两种情况，凝胶色谱柱需要重新装填。

【2、思路点拨】本题深入到蛋白质内部，从蛋白质分子带电性质及数量的角度，引导学生理解电泳法分离蛋白质的原理。含碱性基团较多的蛋白质溶液，在pH近于5时解离程度较大，

蛋白质带正电荷。要使蛋白质内部酸性和碱性基团解离相等呈等电状态，必须提高溶液的pH，使酸性基团解离增加，故蛋白质的等电点提高。根据等电点不同，可以利用电泳法将特定的蛋白质分离出来。

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