课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数名师教学视频（文字实录）

课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

重庆市杨家坪中学 李忠清 【教学目标】：

1.知识与技能

利用选择培养基分离细菌，掌握微生物的计数

2.过程与方法

理解并分析研究思路的形成过程

3.情感、态度与价值观

（1）、理解微生物实验中无菌操作的重要性，形成基本的生物素养。

（2）、形成无菌不在的概念，养成讲究卫生的习惯

【教学重、难点】：

教学重点：对土样的选取和选择培养基的配制

教学难点：对分解尿素的细菌的计数

【教学过程】：

新课导入：我们知道尿素是一种重要的农业氮肥，但是尿素只能被土壤中细

菌分解为NH3才能被植物吸收利用。这是为什么呢？尿素是一种重要的氮肥，然而农作物不能直接吸收利用尿素，而是首先通过土壤中的细菌将尿素分解为氨和CO2 ，这是因为细菌能合成

脲酶

。其中氨气和水转化为氨水，再转化为铵根离子被植物细胞主动运输吸收，CO2被光合作用利用。而本课题目的是对能分解尿素的细菌进行分离和计数。

一、研究思路

（一）筛选菌株

1、PCR研究技术：一种在体外将少量DNA大量复制的技术。此项技术要求使用耐高温的DNA聚合酶。

科学家能从热泉中把耐热细菌筛选出来是因为

热泉的高温条件淘汰了绝大多数微生物

，这样也适用于实验室中微生物的筛选，原理是人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、PH等），同时抑制或阻止其他微生物生长

。

启示：寻找目的菌株时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找

实验室微生物的筛选原理

人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、pH等），同时抑制或阻止其他微生物生长。

3、选择培养基

在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称做选择培养基。

〖思考1〗在该培养基配方中，为微生物的生长提供碳源的是

葡萄糖

，提供氮源的的是尿素

，琼脂的作用是

凝固剂

。

〖思考2〗该培养基对微生物

具有

（具有，不具有）选择作用。如果具有，其选择机制是

只有能够以尿素作为氮源的微生物才能在该培养基上生长

。

（二）、统计菌落数目

在统计菌落数目时，常用来统计样品中活菌数目的方法是稀释涂布平板法

。除此之外，显微镜直接计数也是测定微生物数量的常用方法。

1.

显微镜直接计数：

(1)

原理:利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量。

(2)

优点：技术方便、操作简单。

(3)

缺点：不能区分死菌和活菌。

2.间接计数（活菌计数法）

（1）常用方法：稀释涂布平板法。

（2）原理：1个菌落←1个活菌

（3）计数

【例1】某同学在稀释倍数为106的培养基上测得平板上的菌落数的平均值为234，那么每毫升样品中菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1 mL）（ ）

A.2.34×108

B.2.34×109 C.234

D.23.4 计算公式：每克样品中的菌株数＝(C÷V)×M 【例2】：两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。

1、甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230。

2、乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。你认为这两位同学的作法正确吗？如果有问题，错在哪？

甲：没有重复实验（至少涂布3个平板）。

乙：A组结果误差过大，不应用于计算平均值。

注意事项：

①需培养计算出三个或三个以上的平板菌落求平均数。

②选择菌落数在30～300的平板上计数。

③统计的菌落往往比活菌的实际数目低。

（三）、设置对照

1.目的：排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。

2.实例：P22-23小字部分

(1)A同学出现此结果的可能原因？

a、土样不同

b、培养基污染 (或混入了其他的含氮物质) (2)设置对照实验，帮助A同学排除上述两个可能影响实验结果的因素？

方案一：由其他同学用与A同学相同土样进行实验 结果预测：如果结果与A同学一致，则证明______；如果结果不同，则证明A同学存在__________________ 方案二：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。方案二：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。

这个实例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少

二、实验设计

实验设计的内容包括实验方案、材料用具、实施步骤和时间安排等。实验流程如下：

（一）、土壤取样：从肥沃、酸碱度接近中性的湿润土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。土壤微生物主要分布在距地表3～8cm的近中性土壤中，约70％～80％为细菌。

（二）、制备培养基：制备选择培养基（尿素为唯一氮源）和制备牛肉膏蛋白胨培养基

相同的菌液，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，因此，牛肉膏蛋白胨培养基可以作为对照，用来判断选择培养基是否起到了选择作用。

（三）、样品稀释、取样涂布

因为土壤中各类微生物的数量是不同的，为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。

测定土壤细菌数量，一般选用104、105和106倍的稀释液进行平板培养；测定放线菌的数量，一般选用103、104和105倍稀释液；

测定真菌的数量，一般选用102、103和104倍稀释液。

注意：由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此选择了一个较为宽泛的范围：稀释倍数为103～107。

将10g土样加入盛有90mL无菌生理盐水的锥形瓶中,充分摇匀，吸取上清液1mL，转移至盛有9mL水的无菌试管中，依次等比稀释至107稀释度，并按照由107至103稀释度的顺序分别吸取0.1mL进行平板涂布操作。按照浓度从低到高的顺序涂布平板，不必更换移液管。

（四）、微生物的培养与观察：

培养：将涂布好的培养皿放在相应温度下培养。比较牛肉膏培养基和选择培养基中菌落的数量、形态等，并做好记录。

观察：在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。

选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。

一般来说，在一定的培养条件下(相同的培养基、温度及培养时间)，同种微生物表现出稳定的菌落特征，如菌落形状、大小、隆起程度和颜色。

不同种类的细菌形成的菌落，在大小、形状、光泽度、颜色、硬度、透明度等方面具有一度的特征，菌落特征可作为菌种鉴定的重要依据。

（五）、细菌的计数

当菌落数目稳定时，选取菌落数30~300的平板进行计数。在同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。

三、操作提示

（一）、无菌操作

1、取土用的小铁铲的盛土样的信封在使用前都需要灭菌。

2、应在火焰旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入锥形瓶中，塞好棉塞。

3、在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。

（二）、做好标记

注明培养基种类、培养日期、平板培养样品的稀释度等。

（三）、制定计划

为了提高效率，在操作时更加有条不紊，应当事先规划时间。

四、结果分析与评价

（一）、培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出菌落？

对照的培养皿无菌落说明培养基没有污染；牛肉膏培养基的菌落数目多余选择培养基的菌落数目，说明选择培养基已筛选出一些菌落。

（二）、样品的稀释操作是否成功。

如果得到了2个或2个以上菌落数目在30 ～300平板，说明稀释比较成功，并能够进行菌落的计数。

（三）、重复组的结果是否一致。

如果选取的是同一种土样，统计结果应该相近。如果结果相差太远，需要分析产生差异原因。

五、课题延伸

本课题对能分解尿素的细菌进行初步筛选。对分离的菌种进一步鉴定，需要借助生物化学方法。

1、在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。

2、测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到

伊红-美蓝

培养基上培养，大肠杆菌菌落呈现黑色，通过记算得出水样中大肠杆菌的数量。

六、课堂小结

分解尿素细菌的分离与计数

一、选择培养基的成分：尿素作为唯一的氮源。

二、鉴定方法：在培养基中加入酚红指示剂，若指示剂变红，pH升高，说明细菌能分解尿素

三、统计菌落数目的方法

（1）显微镜直接计数法

（2）间接计数法（稀释涂布平板计数法）

①计算公式：每克样品中的菌株数＝(C÷V)×M ②操作：设置重复组，选择菌落数30～300的平板进行计数。

（3）设置对照

①证明培养基未被污染，用空白培养基作对照。

②证明选择培养基的选择作用：用牛肉膏蛋白胨培养基接种等量同种菌液作对照。