课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数课堂实录【1】

课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

【教学目标】

（一）知识与技能

利用选择培养基分离细菌，运用相关技术解决生产生活中有关微生物的计数

（二）过程与方法

分析研究思路的形成过程，找出共性和差异性

（三）情感、态度与价值观

形成无菌不在的概念，养成讲究卫生的习惯

【教学重点】对土样的选取和选择培养基的配制

【教学难点】对分解尿素的细菌的计数

【教学方法】启发式教学

【教学工具】多媒体课件

【教学过程】

（一）引入新课

上节课我们学习了培养基的配置以及接种技术。下面我们来学习如何进行细菌的分离，获得所需要的目的微生物。

课题背景

1、尿素的利用

尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。

2、细菌利用尿素的原因

土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶

（二）进行新课

一．研究思路

（一）筛选菌株

1、实例：DNA多聚酶链式反应是一种在体外将少量DNA大量复制的技术，此项技术要求使用耐高温（93℃）的DNA聚合酶。

科学家能从热泉中把耐热细菌筛选出来是因为

热泉的高温条件（温度70~80℃），淘汰了绝大多数微生物

，只有Taq细菌被筛选出来。这样也适用于实验室中微生物的筛选。

2、实验室中微生物的筛选原理：

人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、pH等），同时抑制或阻止其他微生物生长

。

点评：生物适应一定环境，环境对生物具有选择作用。所以通过配制选择培养基、控制培养条件等选择目的微生物。

3、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：

〖思考1〗从物理性质看此培养基属于哪类？从功能上属于哪类培养基？

固体培养基（琼脂的作用是

凝固剂

）

选择培养基

该培养基对微生物

具有

（具有，不具有）选择作用。如果具有，其选择机制是

只有能够以尿素作为氮源的微生物才能在该培养基上生长

。

〖思考2〗在此培养基中哪些作为碳源、氮源？

在该培养基配方中，为微生物的生长提供碳源的是

葡萄糖

，提供氮源的的是

尿素

。

4、培养基选择分解尿素的微生物的原理

培养基的氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作为

1

氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。

选择培养基：在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。

㈡.统计菌落数目

1、显微镜直接计数（血细胞计数法）：利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。

2、间接计数法（活菌计数法）

（1）常用方法：稀释涂布平板法。

（2）原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。

每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M 其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表稀释倍数。

〖思考3〗从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数的计算方法是

（平均菌落数÷涂布的稀释液体积）×稀释倍数

。

〖思考4〗利用稀释涂布平板法成功统计菌落数目的关键是

恰当的稀释度

。

〖思考5〗第

二

位同学的结果接近真实值。你认为这两位同学的实验需要改进的操作是第一位同学需设置重复实验组；第二位同学统计的三个菌落数相差太大，说明操作有误，需重新实验。

1．5统计的菌落数比活菌的实际数目

低

。这是因为当两个或多个细胞在一起时，平板上观察到的只是

一个

菌落。因此，统计结果一般用

菌落数

来表示。

注意事项

①为了保证结果准确，一般选择菌落数在30~300的平板上进行计数。

②为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或三个以上的平板中，经涂布，培养计算出菌落平均数。

③统计的菌落往往比活菌的实际数目低。

㈢.设置对照：

1、设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。

2、对照实验是指除了

被测试

的条件外，其他条件都

相同

的实验。满足该条件的称为

对照组

，未满足该条件的称为

实验组

。

实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数目的实验时，A同学从对应的106倍稀释的培养基中筛选出大约150个菌落，但是其他同学在同样的稀释度下只选择出大约50个菌落。分析其原因。

原因：⑴土样不同，⑵培养基污染或操作失误(或者是混入了其他的含氮物质) 〖思考6〗请设计本实验的对照实验组：

方案1：其他同学用A同学的土样进行实验。方案2：A同学以不接种的培养基作为空白对照。

二．实验设计

2

1、实验设计的内容包括实验方案、材料用具、实施步骤和时间安排等。

2、根据图示2－7填写以下实验流程：

配制土壤溶液

菌落计数

系列稀释

涂布平板与培养

㈠.土壤取样

从肥沃、湿润的土壤中取样。微生物绝大多数分布在距地表约3～8cm的土壤层。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。

取土样用的小铁铲和盛土样的信封在使用前都要灭菌。

㈡样品的稀释

应在火焰旁称取土壤10g。

在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行

分离不同的微生物采用不同的稀释度

原因：不同微生物在土壤中含量不同

目的：保证获得菌落数在30～300之间、适于计数的平板

测定土壤中细菌的数量，一般选用104

105

106

测定放线菌的数量，一般选用103

104

105

测定真菌的数量，一般选用102

103

104

〖思考7〗为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？

原因：土壤中各类微生物的数量（单位：株/kg）是不同的。例如在干旱土壤中的上层样本中：好氧及兼性厌氧细菌数约为2 185万，放线菌数约为477万，霉菌数约为23.1万。

㈢.微生物的培养与观察

培养不同微生物往往需要不同培养温度和培养时间。

细菌：30～37℃培养1～2d 放线菌：25～28℃培养5～7d 霉菌：25～28℃的温度下培养3～4d。

在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。

选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。

菌落特征包括菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等方面。

三．操作提示

（一）无菌操作

（二）做好标记

（三）制定计划

四．结果分析与评价

对分离的菌种作进一步的鉴定，还需要借助

生物化学

的方法。

五．课题延伸

1、在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的

脲酶

将尿素分解成了

氨

。氨会使培养基的碱性

增强

，PH 升高

。因此，我们可以通过检测培养基

pH 变化来判断该化学反应是否发生。

2、在以

尿素

为唯一氮源的培养基中加入

酚红

指示剂。培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变

红

，说明该细菌能够

分解尿素

。

〖思考8〗测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到

伊红美蓝

培养基上培养，大肠杆菌菌落呈现

黑

色，通过

3

计算得出水样中大肠杆菌的数量。你认为在该实验中至少应取

三

个水样。

（四）实例探究

例1．对细菌群体生长规律测定的正确的表述是

A．在液体培养基上进行

B．至少接种一种细菌

C．接种一个细菌

D．及时补充消耗的营养物质

解析：细菌群体生长规律的测定是人们在一定条件下进行的。这些条件是：一种细菌、恒定容积的培养基，液体培养基、定时测定细菌总数。在这些条件下，才能测定出细菌的生长规律。测定时只能用一种细菌的子细胞群体的变化规律表达微生物的生长；恒定容积是给微生物提供一定的生存环境；液体培养基才能通过样品推测细菌总数。若接种多种细菌，则会发生种间斗争而不能测定一种微生物的生长规律。在接种时，要保证一定的接种量。

答案：A 例2．在微生物群体生长规律的测定中，种内斗争最显著最激烈的时期是

A．调整期

B．对数期

C．稳定期

D．衰亡期

解析：种内斗争是一种生态因素。种内斗争反应了种内生物对生存空间和生活资源的争夺。在生活空间充裕，营养充足的时候，种内斗争的程度是比较低的。随着微生物个体数目的增加，每个个体的生存空间越来越少，营养物质也越来越少，每个个体对生存空间和资源的争夺也越来越激烈，种内斗争就越来越激烈。由此可知，在稳定期的种内斗争最激烈。在衰亡期，微生物的数目已经开始减少，pH已经极度不适于微生物的生存，次级代谢产物积累到很高的程度，这时的微生物的生存斗争主要是与无机环境的斗争。

答案：C ☆综合应用

例3．（2005年江苏）抗生素作为治疗细菌感染的药物，其高效性和巨大的经济价值使抗生素工业经久不衰。其中青霉素的发现和应用具有划时代的意义。

⑴青霉素发酵产生青霉素。青霉菌的新陈代谢类型是

，青霉素是青霉菌的

代谢产物。

⑵在生产和科研中，常选用处于

期的青霉菌作为菌种或研究材料，因为此时的青霉菌代谢旺盛，

和

比较稳定。

⑶对青霉菌菌体生长情况的测定：取一定体积的发酵液，经离心分离、反复洗涤后，

，再计算发酵罐中菌体的总重量。

解析：青霉菌属于真菌，其代谢类型应为异养需氧型，而青霉素作为它的代谢产物，并不是它生长、繁殖所必需的，所以青霉素应属于次级代谢产物。在测定培养基上青霉菌菌体的生长情况时，常用的方法有两种：一种是测量青霉菌的细胞数目，另一种是测重量，取一定体积的发酵液，经离心分离、反复洗涤后，称菌体的湿重，或烘干后称干重，再由此计算出其中的细胞总重量。在细菌生长的四个主要时期中，因为处于对数期的细菌代谢旺盛，个体的形态和生理特性比较稳定，常作为生产用的菌种和科研的材料。

答案：⑴异养需氧型

次级

⑵对数

个体的形态生理特性

⑶称菌体的湿重（称烘干后的重量）

【板书设计】

2.2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶

一．研究思路

（一）筛选菌株

4

1、实例

2、实验室中微生物的筛选原理

3、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：固体选择培养基

4、培养基选择分解尿素的微生物的原理：选择培养基

（二）统计菌落数目

1、显微镜直接计数（血细胞计数法）

2、间接计数法（活菌计数法）常用方法：稀释涂布平板法。

每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M 其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表稀释倍数。

（三）设置对照

二．实验设计

三．操作提示

四．结果分析与评价

五．课题延伸

【巩固练习】

1．在一个“淀粉—琼脂”培养基的5个圆点位置，分别用不同方法处理，将此实验装置放在37℃恒温箱中，保温处理24h后，将碘液滴在培养基的5个圆点上，其实验结果记录于下表：（C）

淀粉圆点

实验处理方法

碘液处理后的颜色反应

①

新鲜唾液与盐酸混合

蓝黑色

②

经过煮沸的新鲜唾液

蓝黑色

③

接种面包霉

棕黄色

④

只有新鲜的唾液

？

只有一定浓度的蔗糖溶⑤

？

液

请指出④和⑤所发生的颜色反应，以及③接种的面包霉的分泌物分别是

A．棕黄色、棕黄色、淀粉酶

B.蓝黑色、棕黄色、麦芽糖酶

C．棕黄色、蓝黑色、淀粉酶

D.棕黄色、蓝黑色、麦芽糖酶

2．实验测定链霉素对3种细菌的抗生素效应，用3种细菌在事先准备好的琼脂块平板上画3条等长的平行线（3条线均与下图中的链霉素带接触），将平板置于37℃条件下恒温培养3天，结果如图所示。从实验结果分析以下叙述，不正确的是

A．链霉素能阻止结核菌的生长

B．链霉素对结核菌比对霍乱菌更有效

C．链霉素对结核菌比对伤寒菌更有效

D．链霉素可以用于治疗伤寒病人

3．利用生物工程生产啤酒、味精、胰岛素、酸奶的常用菌种分别是

A．酵母菌、枯草杆菌、大肠杆菌、乳酸菌

B．酵母菌、大肠杆菌、青霉菌、乳酸菌

C．酵母菌、谷氨酸棒状杆菌、大肠杆菌、乳酸菌

D．黄色短杆菌、酵母菌、大肠杆菌、乳酸菌

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4．下列操作不属于微生物的分离步骤的是

A．

稀释

B．划线或涂布

C．接斜面

D．培养

5．影响微生物生长的主要环境因素是

A．阳光、温度、水分

B．温度、水分、pH

C．水分、PH、氧

D．温度、pH、氧

答案：1—5

CDCCD

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