课题2　多聚酶链式反应扩增DNA片段教学设计内容推荐

第14课时

多聚酶链式反应扩增DNA片段

蓝山四中

雷军全

[学习目标定位] 1.了解PCR技术的基本操作。

2.理解PCR的原理。

3.讨论PCR的应用。

教学过程

：

【温故知新】

1．酶的作用需要适宜的

和pH，

过高、过酸和

都会破坏酶的

，使酶失活。

2．DNA分子双螺旋结构的特点

(1)DNA分子是由

链构成的,这两条链按

方式盘旋成双螺旋结构。

(2)DNA分子中的

交替连接，排列在外侧，构成基本骨架；

排列在内侧。

(3)两条链上的碱基通过

连接成碱基对。碱基配对的规律是：

与T配对，

与C配对。碱基之间的这种一一对应的关系，叫做

原则。

3. DNA分子复制是指以亲代DNA为

合成子代DNA的过程。这一过程是在细胞有丝分裂的

期和减数

期，随着

的复制而完成的。

4. 细胞内DNA复制的过程

(1)解旋：DNA分子首先利用细胞提供的能量，在

酶的作用下，把两条螺旋的双链解开。

(2)合成子链：分别以解开的

为模板，以游离的四种

为原料，按照碱基互补配对原则，合成与母链互补的子链。

(3)形成子代DNA:每条子链与其对应的母链盘旋成

结构,从而形成两个与亲代DNA

的DNA分子。

【情景导入】

PCR技术在人类社会生活中的应用越来越广泛：比如，科学家们只需要一根头发甚至一个细胞就可以完成“DNA指纹”的鉴定工作，这里实际上就要采用PCR技术。因为一个细胞中的DNA含量实在太少了，人们根本不可能检测到它的指纹；有了PCR技术就好办了，通过PCR技术把这个细胞中的DNA片段扩增1 000万倍，这样DNA量就足够做指纹鉴定了。你知道PCR技术扩增DNA片段需要哪些条件吗？

【探究活动】

探究点一

PCR原理

多聚酶链式反应简称PCR,是一种体外迅速扩增DNA片段的技术,这项技术中DNA复制的过程和细胞内DNA复制的过程是类似的。请结合已学过的DNA分子结构和复制的相关知识,分析PCR的原理。

1．如图

(1)写出各个标号的名称①

；②

；

③

；④

；⑤

；

⑥

；⑦

；⑧

；

⑨

；⑩

。

(2)DNA的两条链是反向平行的，为了明确表示DNA链的方向，通常将DNA的羟基末端称为3′端，将磷酸基团的末端称为5′端，按此原则在图上方框内标出两条链的方向。

答案

左链上5′端,下3′端,右链上3′端,下5′端。

2．细胞内DNA复制条件分析

条件

组分

作用

模板

DNA的 条单链

提供复制的模板

原料

四种 .

合成DNA子链的原料

解旋酶

酶

DNA聚合酶

打开 .

催化 .

能量

为解螺旋和合成子链供能

引物

RNA

为DNA聚合酶提供合成的 .

起点

3. 细胞内DNA复制过程的解析

解旋：在

酶作用下，

DNA两条链打开，形成两条

DNA单链。

↓

引物结合：在DNA单链

端，通过

与DNA 母链结合。

↓

DNA聚合酶结合:DNA聚合酶与模板链结合,标志着单链合成开始。

↓

子链合成：

酶从引物

端开始，将配对的脱

氧核苷酸连接起来。

↓

后续加工：将

切去，并合成空缺处的DNA单链，再由

酶将不连续的DNA子链连接起来，子链和母链再形成

结构。

4．DNA分子体外复制的人工控制

(1)如何在体外将DNA分子的双螺旋结构解开和重新形成?

答案

在80～100 ℃时，DNA双螺旋打开，形成两条DNA单链，称为变性。在50 ℃左右时，两条DNA单链重新形成双螺旋结构，称为复性。

(2)DNA分子体外复制时，所用的DNA聚合酶有什么特殊特点？

答案

能耐高温。

(3)PCR的基本条件有哪些？

答案

一定的缓冲液，DNA模板，四种脱氧核苷酸，热稳定DNA聚合酶，两种引物。

【归纳提炼】

生物体内DNA复制和PCR的区别

解旋

引物

合成子链

特点

Taq DNA聚合酶

循环次数

体内复制

在解旋酶作用下,细胞提供能量,部分解开

一小段RNA

在引物基础上,一条链连续合成,另一条链不连续合成

边解旋边复制,半保留复制

不需要

受生物体自身控制

PCR反应

加热至95 ℃,双链全部解开, 不需解旋酶

可以是RNA或单链DNA分子

片段

分别从两条链的引物端开始，

都是连续合成，控制温度72 ℃

体外迅速扩增

需要

30多次

生物体内的DNA复制和PCR体外DNA扩增都需要模板、

相同点

四种脱氧核苷酸作原料、酶，子链延伸的方向都是从5′端

到3′端，且都需要在一定的缓冲溶液中进行

【活学活用】

1．近20年来，PCR技术(多聚酶链式反应)成为分子生物学实验室的一种常规实验手段，其原理是利用DNA半保留复制，在试管中进行DNA的人工复制(如图)，在短时间内，将DNA扩增几百万倍甚至几十亿倍，从而使实验室所需要的遗传物质不再受限于活的生物体。

(1)加热使DNA双链间的_____________键完全打开，称为___________;而在细胞中是在__________酶的作用下进行的。

(2)如果只需要大量克隆模板DNA中间的某个特定区段，应该加入________种特定的引物。当温度降低至55 ℃时，引物与两条“舒展”的模板的特定位置结合，在DNA聚合酶的作用下，只能在引物的________端连接脱氧核苷酸，两条子链的延伸方向都是

___________________________________。

(3)PCR技术的必需条件，除了模板、原料、酶之外，至少还有三个条件，即液体环境、适宜的________和________，前者由________自动调控，后者则靠________来维持。

(4)通过PCR技术使DNA分子大量复制，如果将一个用15N标记的DNA分子放入试管中，以14N标记的脱氧核苷酸为原料，连续复制四次之后，则15N标记的DNA分子占全部DNA分子总数的比例是________。

探究点二

PCR的反应过程和操作提示

PCR是在PCR仪中完成的，经过多次的循环使DNA的片段得以大量地扩增，这个过程有严格的操作规程。

1．PCR的过程

(1)

(90～95 ℃)：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA。

(2)

(55 ℃左右)：两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，形成局部双链。

(3)

(72 ℃左右)：在Taq DNA聚合酶的作用下，以四种脱氧核苷酸为原料，根据碱基互补配对原则，从引物的5′端→3′端延伸合成与模板互补的DNA链。

2．结合下图实验操作过程，归纳该实验的注意事项

:按照PCR反应体系的配方将所需试剂摆放于实验桌上

↓

:用微量移液器按照配方在微量离心管中依次加入各

组成成分

↓

:盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁

↓

:将微量离心管放在离心机上，离心约10 s，目的是

使反应液集中在离心管底部

↓

:将离心管放入PCR仪中，设置程序进行反应

(1)避免外源DNA污染：所用仪器、缓冲液、蒸馏水等使用前必须进行

。

(2)缓冲液和酶分装成小份，并在

储存。

(3)每添加一种反应成分，更换一个

的枪头。

(4)混匀后离心处理，使反应液集中在

底部。

3．实验中DNA含量的测定

理论上DNA扩增呈指数增长，即一条DNA片段循环n次后的数目为2n，但实际可能会有诸多因素影响DNA含量，所以需要对DNA含量进行测定。

(1)原理：DNA在260 nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰。峰值的大小与DNA的含量有关，可以利用DNA这一特点进行DNA含量的测定。

(2)过程

①稀释：2 μL PCR反应液，加入98 μL蒸馏水，即将样品进行50倍稀释。

②对照调零：以蒸馏水作为空白对照，在波长260 nm处，将紫外分光光度计的读数调节至

零。

③测定：取DNA稀释液100 μL至比色杯中，测定260 nm处的光吸收值。

④计算:DNA含量(μg/mL)=50×(260 nm的读数)×稀释倍数。

【归纳提炼】

PCR扩增需要注意的问题

(1)DNA复制需要引物的原因：DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3′端延伸DNA链。PCR中，引物长度通常为20～30个核苷酸。

(2)当PCR反应体系的温度由变性后快速冷却到50 ℃左右时，引物与模板可结合，一般不需要考虑解开的两个DNA模板链的重新结合，原因是：①模板DNA链比引物长得多而且复杂得多，不易重新结合。②引物和模板之间的碰撞机会远远高于模板互补链之间的碰撞机会。

③加入的引物的量足够大，而模板链数量少。

【活学活用】

2．使用PCR仪具体实验操作顺序应为

(

) ①设计好PCR仪的循环程序

②按配方准备好各组分

③用微量移液器在微量离心管中依次加入各组分

④进行PCR反应

⑤离心使反应液集中在离心管底部

A．②③⑤④①

B．①⑤③②④

C．②③⑤①④

D．④②⑤③①

3．有关下列操作过程的叙述，错误的是

(

) A.PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸

馏水等在使用前必须进行高压灭菌

B.PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份,并在－20 ℃储存

C.PCR所用的缓冲液和酶从冰箱拿出之后，迅速融化

D.在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，

移液器上的枪头都必须更换

课堂小结

巩固练习：

1．用于PCR的引物长度通常为20～30个核苷酸，是一小段

(

) A．DNA

B．RNA C．单链DNA或RNA

D．双链DNA

2．符合PCR反应条件的一项是

(

) ①稳定的缓冲液环境

②DNA模板

③合成引物

④四种脱氧核苷酸

⑤DNA聚合酶

⑥DNA解旋酶

⑦限制酶

⑧温控设备

A．①②③④⑤⑥

B．①②③④⑤⑥⑦⑧

C．③④⑤⑥⑦⑧

D．①②③④⑤⑧

3．PCR利用了DNA的哪种特性原理，来控制DNA的解聚与

结合

(

) A．特异性

B．稳定性

C．热变性

D．多样性

4．下图是PCR技术示意图，请回答下列问题：

(1)标准的PCR过程一般分为________、________、______三大步骤。

(2)引物是此过程中必须加入的物质，从化学本质上来说，____________________________。

(3)将双链DNA____________________，使之变性，_____________________________________。

(4)引物延伸需提供__________________________作为原料。

物是一小段从而导致引