课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数优秀教学设计

课题二

土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

教学案

[学习目标]

1.研究培养基对微生物的选择作用，进行微生物数量的测定。

2.掌握土样的选取和选择培养基的配制方法。

3.掌握分解尿素的细菌的计数方法。

[学习重点]

掌握土样的选取和选择培养基的配制方法。

[学习难点]

掌握分解尿素的细菌的计数方法。

[学习步骤] 步骤一

自主学习

预习新知

一、筛选菌株的思路及统计菌落数目的方法

1．筛选菌株的思路

(1)自然界中目的菌株的筛选

①依据：根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。

②实例：PCR技术过程中用到的耐高温的TaqDNA聚合酶，就是从热泉中筛选出来的Taq细菌中提取出来的。

(2)实验室中目的菌株的筛选

①原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物的生长。

②方法：利用选择培养基分离。

a．选择培养基：允许特定微生物生长，同时阻止或抑制其他种类微生物生长的培养基。

b．实例：选择分解尿素的细菌的培养基，以尿素作为唯一氮源，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。

2．统计菌落数目

(1)常用方法：稀释涂布平板法。

②计算公式：每克样品中的菌株数＝(C÷V)×M。

C：代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数。

V：代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)。

M：代表稀释倍数。

③注意事项

a．为了保证结果准确，一般设置三个平板，选择菌落数在30～300的平板进行计数，

并取平均值。

b．统计的菌落数往往比活菌的实际数目低。原因是当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此，统计结果一般用菌落数而不是用活菌数来表示。

c．设置对照：主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。

(2)其他方法：利用显微镜直接计数。

二、实际设计及操作提示

1．实验设计

2．操作提示

(1)无菌操作

①取土样的用具在使用前都需要灭菌。

②应在火焰旁称取土壤，并在火焰附近将称好的土样倒入锥形瓶中，塞好棉塞。

③在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。

(2)做好标记：本实验使用的平板和试管比较多。为避免混淆，最好使用前就做好标记。

(3)制定计划：对于耗时较长的生物实验，要事先制定计划，以便提高工作效率。

3．菌种鉴定

(1)原理：分解尿素的细菌合成的脲酶将尿素分解为氨，使培养基的碱性增强。

(2)方法：在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂培养细菌，若指示剂变红，可初步鉴定该种细菌能够分解尿素。

步骤二

合作探究

疑难解答

探究一

培养基的类型及统计菌落数目的方法

情景材料：生物适应一定环境，环境对生物具有选择作用。所以通过配制选择培养基、控制培养条件等均可以选择出目的微生物，如将培养基放在高温环境中培养，只能得到耐高温的微生物。

1．培养基的分类标准有哪些？

【提示】

培养基的分类标准有：物理性质、化学组成、目的用途等。

2．选择培养基中特殊成分或因素的作用是什么？

【提示】

选择作用。

要点归纳：1．培养基的分类

标准

培养基类型

固体培养基

物理性质

半固体培养基

液体培养基

化学组成

合成培养基

天然培养基

鉴别培养基

选择培养基

配制特点

加入琼脂较多

加入琼脂较少

不加琼脂

由已知成分配制而成，培养基成分明确

由天然成分配制而成，培养基成分不明确

添加某种指示剂或化学药剂

添加(或缺少)某种化学成分

主要应用

菌种分离、鉴定、计数

菌种保存

工业生产，连续培养

菌种分类、鉴定

工业生产，降低成本

菌种的鉴别

菌种的分离

目的用途

2.选择培养基

(1)选择培养基的制备原理：根据不同微生物的特殊营养要求或其对某化学、物理因素的抗性不同而制备培养基。

(2)选择培养基的制备方法：在培养基中加入某种允许特定种类微生物生长，抑制或阻止其他种类微生物生长的化学成分。

(3)选择培养基的用途：使混合菌株中的劣势菌变成优势菌，提高该菌的筛选率。

(4)实例：加入尿素可得到利用尿素的微生物；加入青霉素分离得到酵母菌和霉菌。

3．显微镜直接计数法

(1)原理：此法利用特定细菌计数板或血球计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量。

(2)方法：用计数板计数。计数板是一块特制的载玻片，上面有一个特定的面积为1 mm2和高为0.1 mm的计数室，在1 mm2的面积里又被划分成25个(或16个)中格，每个中格进一步划分成16个(或25个)小格，但计数室都是由400个小格组成的。如下图所示。

(3)计算公式：每毫升原液所含细菌数＝每小格平均细菌数×400×10 000×稀释倍数。

(4)缺点：不能区分细菌的死活。

4．直接计数法与间接计数法的比较

微生物生长量的测定有计数法、重量法、生理指标法等，但是一般使用计数法，计数法可分为直接计数法和间接计数法。二者比较如下：

主要用具

计数依据

优点

直接计数法

显微镜、细菌计数板

菌株本身

计数方便、操作简单

间接计数法

培养基

培养基上菌落数

计数的是活菌

缺点

死菌、活菌都计算在内

每毫升原液含菌株数＝400×10 000×每小格平均菌株数×稀释倍数

操作较复杂，且有一定误差

计算

公式

每毫升原液含菌株数＝平均菌落数×稀释倍数

所用涂布液的体积mL

探究二

实验设计的相关知识

情景材料：土壤有“微生物的天然培养基”之称。同其他生物环境相比，土壤中的微生物，数量大，种类多。在富含有机质的土壤表层，有更多的微生物生长。

1．为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？

【提示】

土壤中各类微生物的数量(单位：株/kg)是不同的，如在干旱土壤中的上层样本中好氧及兼性厌氧菌数约为2 185万，放线菌数约为477万，霉菌数约为23.1万。所以要获得不同类型的微生物，需要采用不同的稀释度，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。

2．为什么称土壤是“微生物的天然培养基”？

【提示】

由于土壤具备了各种微生物生长所需的营养、水分、空气、酸碱度、渗透压和温度等条件，是微生物生活的良好环境。对微生物来说，是微生物的“大本营”；对人类来说，是最丰富的“菌种资源库”。

要点归纳： 1．实验设计原则

(1)设立重复组：

统计某一稀释度下平板上的菌落数时，要至少涂布三个平板作重复组，增强实验结果的说服力与准确性。

(2)设立两种对照组：

①判断培养基中是否有杂菌污染，需将未接种的选择培养基同时进行培养。

②判断选择培养基是否具有筛选作用，需设立牛肉膏蛋白胨培养基进行接种后培养，观察两种培养基上菌落数目，进行对比得出结论。

2．结果分析

内容

有无杂菌污

染的判断

选择培养基的筛选作用

现象

对照的培养皿中无菌落生长

培养物中菌落数偏高

菌落形态多样，菌落数偏高

牛肉膏培养基上的菌落数大于结论

未被杂菌污染

被杂菌污染

培养物中混入其他杂菌

选择培养基具有筛选作用

选择培养基上的菌落数目

样品的稀释操作

重复组的结果

3.实验注意事项

(1)如图，在三个不同的稀释倍数下分别涂布多个平板，若某一稀释下的所有平板的菌落数目均在30～300之间，则选择该稀释倍数进行记数。

得到3个或3个以上菌落数目在30～300的平板

操作成功

若选择同一种土样，统计结果应接近

样品的稀释和稀释液的取样培养流程示意图

(2)某一稀释倍数下，多个平板中有个别平板上的菌落数目与其他平板差异较大则应该舍去，或重新实验。

(3)计算结果为每克土样中的菌株数，若样品为液体，则计算结果为每毫升样品中的菌株数。

步骤三

练习巩固

思维深化

1、下列关于检测土壤中细菌总数实验操作的叙述中，不正确的是(

) A．用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基，高温、高压灭菌后倒平板

B．取10、10、10倍土壤稀释液和无菌水各0.1 mL涂布不同平板

C．将实验组和对照组平板倒置，37℃恒温培养24～48 h D．确定对照组无菌后，选择菌落数在300以上的平板进行计数

【思路点拨】

解此题的关键是熟练掌握稀释涂布平板法的操作步骤及注意事项。

【解析】

确定对照组无菌后，应选择菌落数在30～300的平板进行计数。

【答案】

D 2．下列关于“土壤中分解尿素的细菌的分离”实验步骤排列正确的是(

) ①土壤取样

②称取10 g土壤加入盛有90 mL无菌水的锥形瓶中

③吸取0.1 mL进行涂布平板

④依次稀释至10、10、10、10、10、10、10稀释度

A．①→②→③→④

B．①→③→②→④

1234567456

C．①→②→④→③ D．①→④→②→③

【解析】

正确的顺序是先取土样，然后称量、溶解并进行梯度稀释，最后进行涂布平板的操作。 【答案】

C 3．用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数，在对应稀释倍数为10的培养基中得到以下几种统计结果，正确的是 (

) A．涂布了1个平板，统计菌落数230 B．涂布了2个平板，统计菌落数215和260，取平均数238 C．涂布了3个平板，统计菌落数21、212和256，取平均值163 D．涂布了3个平板，统计菌落数210、240和250，取平均值233 【解析】

A项只涂布了1个平板，不符合重复原则；B项涂布了2个平板，重复次数不够；C项涂布了3个平板，但是3个平板上菌落数差异过大，实验结果不可信。只有D项操作符合要求，实验结果满足计数的条件。 【答案】

D 4．分离土壤中分解尿素的细菌，对培养基的要求是(

) ①加尿素

②不加尿素

③加琼脂

④不加琼脂

⑤加葡萄糖

⑥不加葡萄糖

⑦加硝酸盐

⑧不加硝酸盐

A．①③⑤⑦

B．②④⑥⑧

C．①③⑤⑧

D．①④⑥⑦

【解析】

要分离土壤中分解尿素的细菌，培养基中尿素应是唯一的氮源，不能加硝酸盐；在固体培养基上形成菌落，要加琼脂作凝固剂；分解尿素的细菌是异养生物，要加有机碳源(如葡萄糖)。 【答案】

C