课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数教学实录与评析

课题2《土壤中分解尿素的细菌的分离与计数》教学设计

一、课题背景

1、尿素的利用

尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。

2、细菌利用尿素的原因

土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶

4、课题目的

①从土壤中分离出能够分解尿素的细菌

②统计每克土壤样品中究竟含有多少这样

的细菌

一.研究思路

㈠.筛选菌株

㈡.统计菌落数目

㈢.设置对照

㈠.筛选菌株

1、实例：

DNA多聚酶链式反应是一种在体外将少量DNA大量复制的技术，此项技术要求使用耐高温（930C）的DNA聚合酶

原因：因为热泉温度70～800C，淘汰了绝大多

数微生物只有Taq细菌被筛选出来。

启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的

要求，到相应的环境中去寻找。

2、实验室中微生物的筛选原理：

人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。

什么是选择性培养基？

3、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：

①从物理性质看此培养基属于哪类？

固体培养基

②在此培养基中哪些作为碳源、氮源？

碳源：葡萄糖、尿素

氮源：尿素

5、培养基选择分解尿素的微生物的原理

培养基的氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。

6、怎样证明此培养基具有选择性呢？

培养基类型

是否接种

目的

结果

实验组

以尿素为唯一氮源的培养基

是

分离尿素细菌

只生长尿素细菌

对照组

牛肉膏蛋白胨培养基

是

判断该培养基有无选择性

生长多种微生物

㈡.统计菌落数目：

1、显微镜直接计数：

利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。

缺点

不能区分死菌与活菌；

不适于对运动细菌的计数；

需要相对高的细菌浓度；

个体小的细菌在显微镜下难以观察；

2.间接计数法（活菌计数法）

⑴原理：在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的，即一个菌落代表原先的一个单细胞。

⑵常用方法：稀释涂布平板法。

每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M 其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表稀释倍数。

㈢.设置对照：

设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。

实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌

落数目的实验时，A同学从对应的106倍稀释的培养基中筛选出大约150个菌落，但是其他同学在同样的稀释度下只选择出大约50个菌落。分析其原因。

原因：⑴土样不同，

⑵培养基污染或操作失误(或者是混入了其他的含氮物质) 方案一：由其他同学用与A同学相同土样进行实验

结果预测：如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。

方案二：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。

小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。

二.实验的具体操作

㈠.土壤取样

从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。

取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。

㈡.制备培养基：

制备以尿素为唯一氮源的选择培养基。

[三]样品的稀释

应在火焰旁称取土壤10g。

在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行

㈣.取样涂布

实验时要对培养皿作好标记。注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。

㈤.微生物的培养与观察

思考：要将哪些培养皿进行培养？

㈤.微生物的培养与观察

培养不同微生物往往需要不同培养温度。

细菌：30～37℃培养1～2d 放线菌：25～28℃培养5～7d 霉菌：25～28℃的温度下培养3～4d。

在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。

如果得到了2个或2个以上菌落数目在30——300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确，需要重新实验。

三.结果分析与评价

1.通过对照实验，若培养物有杂菌污染，菌落数偏高；若培养物混入其他氮源，则菌落形态多样，菌落数偏高，难以选择出分解尿素的微生物。

2.提示：选择每个平板上长有30—300个菌落的稀释倍计算每克样品的菌数最合适。同一稀释倍数的三个重复的菌落数不能相差悬殊，如相差较大，表示实验不精确。

四、操作提示

无菌操作

做好标记

规划时间

五.课外延伸

在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。