课题3　血红蛋白的提取和分离国家获奖教案

蛋白质的提取和分离

一、教学目标：

1、通过阅读教材P64“基础知识”，掌握蛋白质分离的方法凝胶色谱法的原理、缓冲液的制备及作用和蛋白质纯度鉴定的方法电泳法的原理。

2、分析教材P66“实验操作”，掌握蛋白质提取和分离的过程。

3、阅读教材P69“操作提示”，掌握蛋白质分离过程中需注意的问题。

二、教学重点：

1、

掌握蛋白质分离的方法凝胶色谱法的原理、缓冲液的制备及作用和蛋白质纯度鉴定的方法电泳法的原理。

2、

掌握蛋白质分离过程中需注意的问题。

三、教学难点：

1.尝试提取和分离血液中的血红蛋白，体验提取生物大分子的基本过程和方法。

2.了解凝胶色谱法、电泳法等分离生物大分子方法的基本原理。

四、课前准备：预习教材，完成导学案上的基础知识部分

五、教学过程

1、检查导学案的完成情况

2、重难点突破：（先思考问题，再总结后对点练习）

师生共同探究完成以下任务：探究任务一：蛋白质的分离技术

（1）

蛋白质的分离技术（思考下列问题串）

A、

凝胶色谱法的原理和方法是什么？

B、

缓冲液的制备和作用是什么? C、

电泳法的原理是什么？

生物体内的蛋白质多种多样，分离蛋白质常使用的方法是凝胶色谱法和电泳法，都是根据不同蛋白质分子之间的差异来分离的。

1．凝胶色谱法

(1)分离蛋白质的过程(如图B) ①蛋白质混合物上柱。

②洗脱开始，相对分子质量较小的蛋白质扩散进入凝胶颗粒内；相对分子质量较大的蛋白质则被排阻于凝胶颗粒之外。

③相对分子质量较小的蛋白质被滞留；相对分子质量较大的蛋白质向下移动。

④相对分子质量不同的分子完全分开。

⑤相对分子质量较大的蛋白质已从层析柱中洗脱出来，相对分子质量较小的蛋白质还在行进中。

(2)凝胶色谱法的原理

直径大小

运动方式

运动路程

运动速度

洗脱次序

相对分子质量大

较大

垂直向下运动

较短

较快

先流出

相对分子质量小

较小

无规则的扩散运动

较长

较慢

后流出

2.缓冲溶液

(1)概念：在一定范围内，能够抵制外界的酸和碱对溶液pH的影响，维持pH基本不变的溶液。

(2)缓冲溶液的配制：缓冲溶液通常由1～2种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同pH范围内使用的缓冲液。

3．电泳

(1)概念：带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。

(2)原理：在同一电场下，由于各种分子带电性质的差异以及分子本身大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。

(3)常用方法

①琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖本身不带电荷，由于各种分子带电性质、分子大小和形状的不同，在电场中迁移速率不同，从而得以分离。

②聚丙烯酰胺凝胶电泳

a．SDS：使蛋白质发生完全变性，解聚成单条肽链；

b．SDS能与各种蛋白质结合形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质原有的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。

[总结升华] 凝胶色谱法和电泳法的比较

分离依据

分离动力

分子大小

的影响

[对点演练] 1．使用凝胶色谱法分离蛋白质实验中，相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中的行进过程，可表示为(

) 凝胶色谱法

相对分子质量大小

重力

相对分子质量大，移动速度快

电泳

分子带电性质差异、分子大

小和形状等

电场力

分子大，阻力大，移动速度慢

2．下列关于电泳的叙述，不正确的是(

) A．电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程

B．带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动

C．蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少

D．用SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质，蛋白质的电泳迁移率完全取决于分子的大小

探究任务二：蛋白质提取和分离的实验操作[共研探究]

每一种蛋白质的分离纯化方法因其来源和性质不同会有很大差异，下面以哺乳动物红细胞为材料，学习初步分离血红蛋白的方法。

1．样品处理和粗分离

(1)红细胞的洗涤：采用低速短时间离心，吸出上层透明的黄色血浆，将下层暗红色的红细胞液体倒入烧杯，再加入五倍体积的生理盐水，重复洗涤三次，直至上清液中没有黄色，表明红细胞已洗涤干净。

根据上述内容，回答下列问题：

①选用哺乳动物的成熟红细胞作实验材料，因为其没有细胞核和众多细胞器，血红蛋白为有色蛋白。

②洗涤红细胞不能用蒸馏水代替生理盐水，因为生理盐水能保持红细胞的渗透压稳定。而且洗涤次数不能过少，否则无法去除血浆蛋白；离心速度过高或离心时间过长，白细胞、淋巴细胞一同沉淀。

(2)血红蛋白的释放

将洗涤好的红细胞倒入烧杯中：

①加蒸馏水到原血液的体积，其作用是使红细胞吸水涨破。

②加入40%体积的甲苯，其作用是溶解细胞膜。

③置于磁力搅拌器上充分搅拌10 min，其作用是加速红细胞破裂。

④红细胞破裂，释放出血红蛋白。

(3)分离血红蛋白溶液

①分离过程

混合液―→离心管――→溶液分层―→离心管中液体

――→

除去脂溶性沉淀层―→分10 min过滤液漏斗――→分出下层的红色透明液体(血红蛋白溶液) ②离心管中溶液分层示意图

静置2 000 r/min滤纸

(4)透析

①目的：a.除去样品中相对分子质量较小的杂质。

b．用于更换样品的缓冲液。

②原理：透析袋能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋内。

③过程：取1 mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300 mL的物质的量浓度为20 mmol/L的磷酸缓冲液中(pH为7.0)，透析12 h。

2．凝胶色谱操作

(1)凝胶色谱柱的制作

①取长40 cm，内径1.6 cm的玻璃管，两端需用砂纸磨平。

②柱底部制作：选择适合的橡皮塞→橡皮塞打孔→挖出凹穴→安装移液管头部→覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱将橡皮塞上部包好。

③柱顶部制作：打孔→安装玻璃管。

④将上述三部分按相应位置组装成一个整体。

(2)凝胶色谱柱的装填

计算：根据色谱柱的内体积计算所需凝胶量

↓

凝胶溶胀：凝胶用蒸馏水充分溶胀后，配成凝胶悬浮液

↓

固定：将色谱柱垂直固定在支架上

↓

装填：将凝胶悬液一次性装填入色谱柱内

↓

洗涤平衡：用20 mmol/L的磷酸缓冲液(pH＝7.0)洗涤平衡凝胶12 h，使凝胶装填紧密

(3)样品的加入和洗脱

打开流出口，使缓冲液与凝胶面平齐，关闭出口

↓

用吸管将

1_mL样品加到色谱柱顶端，打开出口，使样品进入凝胶层后，关闭出口

↓

小心加入物质的量浓度为

20_mmol/L的磷酸缓冲液到适当高度后，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口，开始洗脱

↓

待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每

5_mL收集一管，连续收集

3．纯度鉴定

判断纯化的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质纯度的鉴定。鉴定的方法中，使用最多的是SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳。

[总结升华] 1．血液样品处理后发生的变化

(1)正常现象：由于血红蛋白与氧气结合呈鲜红色，与二氧化碳结合呈暗红色，所以刚分离的血红蛋白溶液呈红色。

(2)分层不明显的原因：洗涤次数少，未完全除去血浆蛋白。

(3)红细胞不纯净的原因：离心速度过高或离心时间过长，使白细胞和淋巴细胞一同沉淀。

2．判断装填的凝胶色谱柱是否成功

(1)判断方法：

①在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填均匀。

②加入大分子的有色物质，观察色带移动情况。

(2)成功的标准及调整：

①判断标准：若色带均匀、狭窄、平整，说明性能良好。

②调整方法：若色谱柱内出现纹路，可轻轻敲打柱体以消除，若消除不了则重新装柱。

③色谱柱内不能有气泡存在，一旦发现有气泡，必须重装。

3．血红蛋白分离效果的判断

(1)若血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整地随洗脱液缓慢流出，则装填成功，分离操作正确。

(2)若血红蛋白的红色区带歪曲、散乱、变宽，则说明分离效果不好，装填不成功。

【易错易混】总结

(1)凝胶色谱柱的直径不宜过大，直径过大，易造成洗脱液体积增大，样品的稀释浓度过大。

(2)在装填凝胶色谱柱时，要注意不得有气泡存在，气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果；同时在凝胶色谱操作中，不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。一旦发生以上现象，凝胶色谱柱必须重新装填。

(3)洗脱液的流速是影响分离效果的重要因素之一，洗脱液应维持流速的恒定，即维持洗脱液加在色谱柱上的压力恒定。

[对点演练] 3．下列说法不正确的是(

) A．在一定范围内，缓冲溶液能够抵制外界的酸和碱对溶液pH的影响，维持pH基本不变

B．缓冲溶液通常由1～2种缓冲剂溶解于水中配制而成

C．电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程

D．透析袋能使大分子自由进出，而将小分子保留在袋内

3、课后小结（师生引导学生总结）

4、典例练习（完成导学案后面的练习）