课题3　血红蛋白的提取和分离优秀教学设计内容

选修1专题5课题3《血红蛋白的提取和分离》

教学设计

一、课题目标

1.知识目标

a.说出从血液中初步获取血红蛋白的原理和方法。

b.说明凝胶色谱法的原理和方法。

c.说出电泳的基本原理和方法。

2.能力目标

运用凝胶色谱法对血红蛋白进行分离纯化。

3.情感目标

锻炼科学的思维方法，培养实事求是的科学态度。

二、课题重点

凝胶色谱法的原理和方法。

三、课题难点

样品的预处理；色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。

四

教学流程

课题背景：蛋白质是生命活动的主要承担者，是细胞内含量最高的有机化合物。对蛋白质的研究有助于人们对生命过程的认识和理解。所以需要从细胞中提取蛋白质进行研究。怎样提取蛋白质呢？

提出课题背景，展示课题目标。

课题目标

1.说出从血液中初步获取血红蛋白的原理和方法；

2.说明凝胶色谱法的原理和方法；

3.说出电泳的基本原理和方法；

4.运用凝胶色谱法对血红蛋白进行分离纯化。

一、基础知识

（一）蛋白质提取与分离的依据

回忆：蛋白质的物理化学性质：形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、亲和力等千差万别，由此提取和分离各种蛋白质。得出：蛋白质提取与分离的依据。

（二）方法及原理

凝胶色谱法：根据相对分子质量的大小分离蛋白质

电泳法：根据分子带电性质的差异以及分子本身大小、形状的不同分离蛋白质

1.凝胶色谱法

（1）材料：凝胶的种类和特点

多孔性，多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。

（2）原理：观察教材图5-13凝胶色谱法分离蛋白质的原理，讲解分离过程。

步骤：混合物上柱→洗脱→大分子流动快、小分子流动慢→收集大分子→收集小分子

原理：当相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢；相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。

2.缓冲溶液

联系血液缓冲对物质相关知识，讲解缓冲溶液的概念、作用、配制。

(1)概念：在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液pH发生明显变化的溶液。

(2)作用：能够抵制外界的酸或碱的对溶液的pH的影响，维持pH基本不变。

(3)配制：通常由1－2种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同pH范围内使用的缓冲液。

由弱酸和相应的强碱弱酸盐溶解于水中。如H2CO3/NaHCO3，NaH2PO4/Na2HPO4等。

(4)本实验使用的是磷酸缓冲液(NaH2PO4 /Na2HPO4 ),目的是利用缓冲液模拟细胞内的pH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察（红色）和科学研究（活性）。

3凝胶电泳法：

（1）原理：不同蛋白质的？不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。

［思考］阅读投影补充材料后，填写下表：

[来源学科网ZXXK]

电荷性质

电荷量

分子形状

分子大小

决定运动方向

√

形成库仑力

√

形成阻力

√

√

决定运动速率

学+科+网Z+X+X+K][来源

√

√

√

（2）分离方法：琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺经胶电泳等。

（3）分离过程：在一定pH下，使蛋白质基团带上正电或负电；加入带负电荷多的SDS，形成“蛋白质－SDS复合物”，使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小。

二、实验操作

（一）样品处理

（1）红细胞的洗涤：

①目的：去除杂蛋白。

②为防止血液凝固，应先加入柠檬酸钠。

③所用洗涤液：是五倍体积的生理盐水（质量分数为0.9%的NaCl溶液）。

④缓慢搅拌，采用低速短时间离心。

⑤洗涤干净的标准是上清液没有黄色。

（2）血红蛋白的释放：

在蒸馏水和甲苯的作用下，红细胞破裂，释放出血红蛋白。

（3）分离血红蛋白溶液：（方法）离心。

试管中的溶液分为4层，从上往下依次是：

①无色透明的甲苯层。

②白色薄层固体：脂溶性物质沉淀层。

③红色透明液体：血红蛋白溶液层。

④暗红色沉淀层：红细胞破碎物沉淀。

（4）透析：

①方法：取1mL血红蛋白溶液装入透析袋，将透析袋放入盛有300mL物质的量浓度为20 mmol/L磷酸缓冲液（pH为7）中，透析12h。

②目的：去除样品中分子量较小的杂质。

③原理：透析袋能使小分子自由进出，而将大分子物质保留在袋内。

（二）凝胶色谱操作

1.凝胶色谱柱的制作

指导学生观察教材图5－19，讲解制作步骤：打孔→挖穴→安管→覆网→纱包→插管

。

2.凝胶色谱柱的装填

①材料：实验所用凝胶是交联葡聚糖凝胶。

②方法：凝胶用蒸馏水充分溶胀后，配成凝胶悬浮液，一次性缓慢倒入色谱柱内。不能有气泡存在。然后用300mL物质的量浓度为20 mmol/L磷酸缓冲液充分洗涤平衡12h，使凝胶装填紧密。

3.样品的加入和洗脱

使吸管管口沿管壁将样品缓慢加入色谱柱内，不要破坏凝胶面。待红色的蛋白质接近色谱柱低端时，用试管收集流出液，每5mL收集一管，连续收集。

三、操作提示

提醒学生关注几个方面的操作提示。

1.红细胞的洗涤：

洗涤次数不能过少；低速、短时离心。

2.色谱柱的装填：

装填尽量紧密，降低颗粒间隙；无气泡；洗脱液不能断流。

3.凝胶的预处理：

沸水浴法时间短，还能除去微生物和气泡。

4. 色谱柱成功标志：

红色区带均匀一致地移动。

四、结果分析与评价

1.血液样品的处理：分层明显→样品处理完成

2.糖—2000或红色葡聚糖，若色带均匀、狭窄、平整→装填成功。

3.血红蛋白的分离

血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随洗脱液缓慢流出，分离成功。

五、本节小结：