课题3　血红蛋白的提取和分离教学设计与反思

血红蛋白的提取和分离

晋城市阳城县第一中学校

郭育芳

[学习导航] 1.通过阅读教材P64“基础知识”，掌握蛋白质分离的方法凝胶色谱法的原理、缓冲液的制备及作用和蛋白质纯度鉴定的方法电泳法的原理。2.分析教材P66“实验操作”，掌握蛋白质提取和分离的过程。3.阅读教材P69“操作提示”，掌握蛋白质分离过程中需注意的问题。

[重难点击] 1.尝试提取和分离血液中的血红蛋白，体验提取生物大分子的基本过程和方法。2.了解凝胶色谱法、电泳法等分离生物大分子方法的基本原理。

第一环节:注重基础

一、蛋白质的分离技术

1.蛋白质的分离依据

根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等，可以用来分离不同种类的蛋白质。

2.凝胶色谱法

(1)概念：也称做分配色谱法，是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。

形态：微小的多孔球体(2)凝胶的特点组成：大多数由多糖类化合物构成结构：内部有许多贯穿的通道(3)常用凝胶：葡萄糖或琼脂糖。

(4)分离原理

①相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢，通过凝胶的时间较长。

②相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快，通过凝胶的时间较短。

3.缓冲溶液

(1)作用：在一定范围内，缓冲溶液能够抵制外界的酸和碱对溶液pH的影响，维持pH基本不变。

(2)配制：通常由1～2种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同pH范围内使用的缓冲液。

(3)意义：为了能够在实验室条件下准确模拟生物体内的过程，保持体外溶液的pH与体内环境中的pH基本一致。

4.电泳

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(1)概念：带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。

(2)原理

①带电粒子：许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团会带上正电或负电。

②迁移动力与方向：在电场的作用下，带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。

③分离依据：电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。

(3)常用的电泳方法：琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。

第二环节:重难点突破

1.凝胶色谱法

(1)结合上图，根据凝胶色谱法的分离原理，填表分析不同大小的分子洗脱后的次序。

直径大小

运动方式

运动路程

运动速度

洗脱次序

(2)结合上图，分析为什么相对分子质量较大的蛋白质会先从色谱柱中洗脱出来？

答案

相对分子质量较小的蛋白质由于扩散作用进入凝胶颗粒内部，而被滞留；相对分子质量较大的蛋白质被排阻在凝胶颗粒外面，在颗粒之间迅速通过。

(3)凝胶色谱法分离蛋白质时通过一次洗脱能否将所需蛋白质与其他杂质彻底分离？

答案

不能。相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶颗粒内部，移动距离较近，移动速度较快，先洗脱出来；但相对分子质量较小的蛋白质可能进入凝胶颗粒内部，也可能不进入，导致部分相对分子质量较小的蛋白质可能与相对分子质量较大的蛋白质一起洗脱出来。

2.电泳

(1)从电荷方面思考，适合电泳法分离的各种分子需具备什么条件？

答案

各种分子应带有不同种类和不同量的电荷。

- 2 - 相对分子质量大

较大

垂直向下运动

较短

较快

先流出

相对分子质量小

较小

无规则的扩散运动

较长

较慢

后流出

(2)SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质是否依据蛋白质所带电荷的差异？为什么？

答案

否。因为SDS能与蛋白质结合，形成蛋白质－SDS复合物，SDS它所带负电荷的量远大于蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同蛋白质间的电荷差异，使电泳迁移率完全由蛋白质分子的大小决定。

归纳总结

琼脂糖凝胶电泳和SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳的两点区别

1分离原理不同

①琼脂糖凝胶电泳依据分子所带电荷的差异和分子大小、形状等。

②SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳则完全取决于分子大小，而非电荷性质和分子形状。

2用途不同

①琼脂糖凝胶电泳广泛应用于核酸的研究中，用于分离大分子核酸。

②SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳则广泛应用于分离蛋白质和相对分子质量较小的核酸。

第三环节:练习巩固

1.凝胶色谱法分离蛋白质时由色谱柱下端最先流出的是(

) A.相对分子质量较小的蛋白质

B.相对分子质量较大的蛋白质

C.凝胶颗粒

D.葡萄糖或琼脂糖分子

答案

B 解析

凝胶色谱法分离蛋白质的原理是依据蛋白质分子相对分子质量的大小，相对分子质量大的分子不能进入凝胶内部的通道，路程较短，移动速度快，先洗脱出来；相对分子质量小的分子能够进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度慢，后洗脱出来，因此最先流出的应是相对分子质量较大的蛋白质，而凝胶颗粒是不能流出的。

2.有关凝胶色谱法和电泳法的说法，正确的是(

) A.它们都是分离蛋白质的重要方法

B.它们的原理相同

C.使用凝胶色谱法需要使用缓冲溶液而电泳不需要

D.以上说法都正确

答案

A 解析

不同蛋白质的相对分子质量不同，因此凝胶色谱法可以根据相对分子质量的大小分离蛋白质；电泳法中带电分子迁移速度不仅与分子大小有关，也与分子所带的电荷有关，所以A正确；B错误；这两种方法都用到缓冲溶液，以调节溶液的酸碱度，所以C错误。

二、实验操作和操作提示

第一环节:注重基础

1.样品处理

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(1)红细胞的洗涤

①目的：去除杂蛋白。

②方法：低速短时间离心。

③标准：直至上清液不再呈现黄色。

(2)血红蛋白的释放

加入加入10 min红细胞蒸馏水――→到原血液的体积40%――――――→磁力搅拌器上搅拌――→血红蛋白释放。

体积的甲苯(3)分离血红蛋白溶液

2 000 r/min离心10 min①方法：混合液―――――――――――――→分层。

②分层结果(自上而下)：

第1层：无色透明的甲苯层。

第2层：脂溶性物质的沉淀层——白色薄层固体。

第3层：血红蛋白的水溶液——红色透明液体。

第4层：其他杂质的暗红色沉淀物。

③结果处理：将试管中的液体用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。

2.透析——粗分离

(1)过程：取1 mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将其放入盛有300 mL的物质的量浓度为20 mmol/L的磷酸缓冲液中(pH为7.0)，透析12 h。

(2)原理：透析袋能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋内。

(3)目的：去除样品中相对分子质量较小的杂质。

3.凝胶色谱操作——纯化

(1)凝胶色谱柱的制作

↓

(2)凝胶色谱柱的装填：凝胶用蒸馏水充分溶胀后，配成凝胶悬浮液，一次性缓慢倒入

凝胶色谱柱内

↓



冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口(3)样品的加入②加样：用吸管小心地将1 mL透析后的样品

加到色谱柱的顶端，注意不要破坏凝胶面③加样后：打开下端出口，使样品渗入凝胶床内

↓

①加样前：打开流出口，使柱内凝胶面上的缓

(4)洗脱：关闭下端出口，加入磷酸缓冲液，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口，进行洗脱

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4.SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳——纯度鉴定

判断纯化的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质纯度的鉴定。鉴定方法中，使用最多的是SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳。

5.操作提示

(1)红细胞的洗涤：洗涤次数、离心速度与离心时间十分重要。洗涤次数过少，无法除去血浆蛋白；离心速度过高和时间过长会使白细胞等一同沉淀，达不到分离的效果。

(2)色谱柱填料的处理：商品凝胶使用前需直接放在洗脱液中膨胀，可以将加入洗脱液的湿凝胶用沸水浴加热，加速膨胀。

(3)凝胶色谱柱的装填：在装填凝胶柱时，不得有气泡存在。气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。

(4)蛋白质的分离：如果红色区带均匀一致地移动，说明色谱柱制作成功。

第二环节:重难点突破

1.实验操作过程

(1)材料的选择：与其他真核细胞相比，哺乳动物成熟红细胞有什么特点？这一特点对你进行蛋白质的分离有什么意义？

答案

①哺乳动物成熟红细胞内没有细胞核和各种复杂细胞器，排除了其他物质对实验结果的干扰。②血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。

(2)洗涤红细胞的目的是什么？你如何知道红细胞已洗涤干净？

答案

洗涤的目的是去除血浆蛋白；离心后的上清液不再呈现黄色，证明红细胞已洗涤干净。

(3)在血红蛋白释放过程中，蒸馏水和甲苯的作用分别是什么？

答案

①蒸馏水可以使红细胞吸水涨破，释放细胞内的血红蛋白；②甲苯是有机溶剂，可以溶解细胞膜，有助于血红蛋白的释放。

(4)血红蛋白释放后的混合液经离心后分为哪几层？如何获得血红蛋白溶液？

答案

①分为4层：从上往下数，第1层为无色透明的有机溶剂(甲苯)，第2层为白色的脂类物质，第3层为红色透明的血红蛋白溶液，第4层为暗红色的红细胞破碎物沉淀。

②分层的液体→过滤除去脂溶性沉淀层→分液得下层的血红蛋白溶液。

(5)将收集的血红蛋白溶液放在透析袋中进行透析，透析的目的是什么？

答案

血红蛋白是大分子物质，不能透过透析袋，这样可以去除相对分子质量较小的杂质。

2.凝胶色谱操作

(1)在制作凝胶色谱柱时，凝胶色谱柱的高度不足或直径过大对洗脱效果分别有何影响？

答案

①凝胶色谱柱的高度是样品随缓冲溶液流过的距离，凝胶色谱柱的高度不足会导致达不到分离效果；

②凝胶色谱柱的直径大小并不影响分离效果，但直径过大会导致洗脱液体积大，样品稀释度

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大，使实验现象不明显。

(2)试从凝胶色谱的分离原理分析，凝胶的装填为什么要紧密、均匀？

答案

如果凝胶装填得不够紧密、均匀，就会在色谱柱内形成无效的空隙，使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过，搅乱洗脱液的洗脱次序，影响分离的效果。

(3)在装填凝胶柱时，如果有气泡存在，会对蛋白质的分离有何影响？

答案

气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。

归纳总结

血红蛋白的提取和分离各操作的主要目的

操作

目的

红细胞的洗涤

去除杂蛋白，如血浆蛋白

血红蛋白的释放

使红细胞破裂，释放血红蛋白 分离血红蛋白溶液

经过离心使血红蛋白与其他杂质分离开

透析

除去样品中相对分子质量较小的杂质

纯化

除去相对分子质量较大的杂质蛋白质

第三环节:练习巩固

3.下列关于凝胶色谱法分离血红蛋白实验中样品的加入和洗脱的叙述中，不正确的是(

) A.加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到凝胶面的下面

B.用吸管小心地将1 mL透析后的样品加到色谱柱的顶端，不要破坏凝胶面

C.加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内

D.等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口

答案

A 解析

加样前，应打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到与凝胶面

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平齐，关闭出口，而不应使缓冲液下降到凝胶面的下面，A项不正确。加样时不要破坏凝胶面，B项正确。加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，C项正确。等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口，再加缓冲液，D项正确。

4.下图表示血红蛋白提取和分离的部分实验装置，请据图分析回答下列问题：

(1)血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分，其在红细胞中的作用体现了蛋白质具有 功能。

(2)甲装置用于 ，目的是去除样品中 的杂质，图中A是 。B是 溶液。

(3)用乙装置分离蛋白质的方法叫 ，是根据 分离蛋白质的有效方法。

(4)乙装置中，C是 ，其作用是 。

(5)用乙装置分离血红蛋白时，待 时，用试管收集流出液，每5 mL收集一管，连续收集6管，图中试管序号表示收集的先后。经检测发现，试管②和试管⑤中蛋白质含量最高，则试管⑤中的蛋白质相对分子质量比血红蛋白 (填“大”或“小”)。

答案

(1)运输

(2)透析(粗分离) 相对分子质量较小

磷酸缓冲液

血红蛋白

(3)凝胶色谱法

相对分子质量的大小

(4)磷酸缓冲液

洗脱血红蛋白

(5)红色的蛋白质接近色谱柱底端

小

解析

(1)血红蛋白能携带氧气，体现了蛋白质具有运输功能。(2)甲装置为透析装置，目的是去除样品中相对分子质量较小的杂质。其中A是磷酸缓冲液，B是血红蛋白溶液。(3)乙装置分离蛋白质的方法叫凝胶色谱法，是根据蛋白质的相对分子质量大小分离蛋白质的有效方法。(4)乙装置中，C溶液为磷酸缓冲液，作用是洗脱血红蛋白。(5)待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5 mL收集一管，连续收集。最先收集到的蛋白质是血红蛋白分子，则试管②内的大量蛋白质为血红蛋白。由于试管⑤晚于试管②收集得到，

因此其内收集到的蛋白质比血红蛋白分子移动速度慢，其相对分子质量比血红蛋白小。

规律方法

凝胶色谱法分离蛋白质中确定收集蛋白质时间的方法

(1)血红蛋白的收集：利用血红蛋白的颜色，当红色的蛋白质接近色谱柱底端时，就要收集流

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出液。

(2)其他无色蛋白质的收集：可以在实验时加入指示剂以掌握样品的移动位置，确定最佳的收集时机。

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