课题3　血红蛋白的提取和分离教学实录与评析

课题5.3 血红蛋白的提取和分离

一、教学目标

（一）知识与技能

1、尝试从血液中提取和分离血红蛋白

2、了解凝胶色谱法和电泳法等分离生物大分子的基本原理

（二）过程与方法

体验血红蛋白的提取和分离实验过程中对实验操作的严格要求，按照操作提示严密进行相关步骤。

（三）情感、态度与价值观

形成科学的思维方式，发展生物学科素养和人文精神。

二、教学重点

凝胶色谱法的原理和方法

三、教学难点

样品的预处理；色谱柱填料的处理和色谱柱的装填

四、教学方法

启发式与探究式相结合的方法

五、教学工具

PPT课件、平板电脑

六、教学过程

（一）引入新课

蛋白质是生命活动的主要承担者，是细胞中含量最高的有机物，是占细胞干重比例最大的化合物。从细胞中提取不同的蛋白质有助于我们对蛋白质的研究，深化人们对生命过程的认识和理解。那么，我们应该怎么提取蛋白质呢？

（二）开展新课

[学习导航] 1.通过阅读教材P64“基础知识”，掌握蛋白质分离的方法凝胶色谱法的原理、缓冲液的制备及作用和蛋白质纯度鉴定的方法电泳法的原理。

2.分析教材P66“实验操作”，掌握蛋白质提取和分离的过程。

3.阅读教材P69“操作提示”，掌握蛋白质分离过程中需注意的问题。

[重难点击] 1.尝试提取和分离血液中的血红蛋白，体验提取生物大分子的基本过程和方法。

2.了解凝胶色谱法、电泳法等分离生物大分子方法的基本原理。

【基础梳理】

1.蛋白质的分离依据

根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小

、所带

电荷

的性质和多少、溶解度、

和对其他分子的亲和力等，可以用来分离不同种类的蛋白质。

2.凝胶色谱法

(1)概念：也称做

分配色谱法

，是根据

相对分子质量的大小

分离蛋白质的有效方法。

(2)凝胶的特点

(3)常用凝胶：

或琼脂糖。

(4)分离原理

①相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程

，移动速度

，通过凝胶的时间

。

②相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶_____移动，路程

，移动速度

，通过凝胶的时间

。

3.缓冲溶液

(1)作用：在一定范围内，缓冲溶液能够抵制

对溶液pH的影响，维持pH基本不变。

(2)配制：通常由1～2种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的_____ _____就可以制得

的缓冲液。

(3)意义：为了能够在实验室条件下准确模拟生物体内的过程，保持_____ __________与体内环境中的pH基本一致。

4.电泳

(1)概念：带电粒子在

的作用下发生

的过程。

(2)原理

①带电粒子：许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有

的基团，在一定的pH下，这些基团会带上

。

②迁移动力与方向：在电场的作用下，带电分子会向着与其_____________的电极移动。

③分离依据：电泳利用了待分离样品中各种分子

以及分子本身的

、

的不同，使带电分子产生

，从而实现样品中各种分子的分离。

(3)常用的电泳方法：

电泳和

电泳。

【互动探究】

1.凝胶色谱法

(1)结合右图，根据凝胶色谱法的分离原理，填表分析不同大小的分子洗脱后的次序。

(2)结合右图，分析为什么相对分子质量较大的蛋白质会先从色谱柱中洗脱出来？

答案

相对分子质量较小的蛋白质由于扩散作用进入凝胶颗粒内部，而被滞留；相对分子质量较大的蛋白质被排阻在凝胶颗粒外面，在颗粒之间迅速通过。

(3)凝胶色谱法分离蛋白质时通过一次洗脱能否将所需蛋白质与其他杂质彻底分离？

答案

不能。相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶颗粒内部，移动距离较近，移动速度较快，先洗脱出来；但相对分子质量较小的蛋白质可能进入凝胶颗粒内部，也可能不进入，导致部分相对分子质量较小的蛋白质可能与相对分子质量较大的蛋白质一起洗脱出来。

2.电泳

(1)从电荷方面思考，适合电泳法分离的各种分子需具备什么条件？

答案

各种分子应带有不同种类和不同量的电荷。

(2)SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质是否依据蛋白质所带电荷的差异？为什么？

答案

否。因为SDS能与蛋白质结合，形成蛋白质－SDS复合物，SDS它所带负电荷的量远大于蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同蛋白质间的电荷差异，使电泳迁移率完全由蛋白质分子的大小决定。

【归纳总结】

琼脂糖凝胶电泳和SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳的两点区别

(1)分离原理不同

①琼脂糖凝胶电泳依据分子所带电荷的差异和分子大小、形状等。

②SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳则完全取决于分子大小，而非电荷性质和分子形状。

(2)用途不同

①琼脂糖凝胶电泳广泛应用于核酸的研究中，用于分离大分子核酸。

②SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳则广泛应用于分离蛋白质和相对分子质量较小的核酸。

【活学活用】

1.凝胶色谱法分离蛋白质时由色谱柱下端最先流出的是

A.相对分子质量较小的蛋白质

B.相对分子质量较大的蛋白质

C.凝胶颗粒

D.葡萄糖或琼脂糖分子

解析

凝胶色谱法分离蛋白质的原理是依据蛋白质分子相对分子质量的大小，相对分子质量大的分子不能进入凝胶内部的通道，路程较短，移动速度快，先洗脱出来；相对分子质量小的分子能够进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度慢，后洗脱出来，因此最先流出的应是相对分子质量较大的蛋白质，而凝胶颗粒是不能流出的。

2.有关凝胶色谱法和电泳法的说法，正确的是

A.它们都是分离蛋白质的重要方法

B.它们的原理相同

C.使用凝胶色谱法需要使用缓冲溶液而电泳不需要

D.以上说法都正确

解析

不同蛋白质的相对分子质量不同，因此凝胶色谱法可以根据相对分子质量的大小分离蛋白质；电泳法中带电分子迁移速度不仅与分子大小有关，也与分子所带的电荷有关，所以A正确，B错误；

这两种方法都用到缓冲溶液，以调节溶液的酸碱度，所以C错误。

二、实验操作和操作提示

1.样品处理

(1)红细胞的洗涤

①目的：去除

。

②方法：

。

③标准：直至上清液不再呈现

。

(2)血红蛋白的释放

加入加入红细胞―――――→到原血液的体积――――――――――→磁力搅拌器上搅拌_______40%体积的甲苯

min――――→血红蛋白释放。

(3)分离血红蛋白溶液

①方法：混合液

分层。

②分层结果(自上而下)：第1层：无色透明的

。

第2层：脂溶性物质的

——白色薄层固体。

第3层：

的水溶液——

透明液体。

第4层：其他杂质的暗红色沉淀物。

③结果处理：将试管中的液体用

过滤，除去

沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的

液体。

2.透析——粗分离

(1)过程：取1 mL的

溶液装入

中，将其放入盛有300 mL的物质的量浓度为20 mmol/L的

中(pH为7.0)，透析12 h。

(2)原理：透析袋能使

自由进出，而将

保留在袋内。

(3)目的：去除样品中

的杂质。

3.凝胶色谱操作——纯化

(1)凝胶色谱柱的制作

↓

(2)凝胶色谱柱的装填：凝胶用

充分溶胀后，配成凝胶悬浮液，

缓慢倒入凝胶色谱柱内

↓

(3)样品的加入

↓

(4)洗脱：

下端出口，加入磷酸缓冲液，连接

，_____

下端出口，进行洗脱

4.SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳——纯度鉴定：判断纯化的蛋白质是否达到要求，需要进行

的鉴定。鉴定方法中，使用最多的是______

。

5.操作提示

(1)红细胞的洗涤：

、离心速度与

十分重要。洗涤次数过少，无法除去

蛋白；离心速度过高和时间过长会使白细胞等一同沉淀，达不到分离的效果。

(2)色谱柱填料的处理：商品凝胶使用前需直接放在

中膨胀，可以将加入洗脱液的湿凝胶用沸水浴加热，加速膨胀。

(3)凝胶色谱柱的装填：在装填凝胶柱时，不得有气泡存在。气泡会搅乱洗脱液中蛋白质

的

，降低

。

(4)蛋白质的分离：如果红色区带均匀一致地移动，说明色谱柱制作成功。

【互动探究】

1.实验操作过程

(1)材料的选择：与其他真核细胞相比，哺乳动物成熟红细胞有什么特点？这一特点对你进行蛋白质的分离有什么意义？

答案

①哺乳动物成熟红细胞内没有细胞核和各种复杂细胞器，排除了其他物质对实验结果的干扰。

②血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。

(2)洗涤红细胞的目的是什么？你如何知道红细胞已洗涤干净？

答案

洗涤的目的是去除血浆蛋白；离心后的上清液不再呈现黄色，证明红细胞已洗涤干净。

(3)在血红蛋白释放过程中，蒸馏水和甲苯的作用分别是什么？

答案

①蒸馏水可以使红细胞吸水涨破，释放细胞内的血红蛋白；

②甲苯是有机溶剂，可以溶解细胞膜，有助于血红蛋白的释放。