课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数优秀公开课教案

2.2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

【学习目标】

1.简述尿素在生产实践中的作用及分解尿素的细菌的作用。

2.研究培养基对微生物的选择作用。

3.进行土壤中分解尿素细菌的分离与计数。

4.简述活菌计数技术的应用。

【重点难点】

课题重点：对土样的选取和选择培养基的配制

课题难点: 对分解尿素的细菌的计数

一、研究培养基对微生物的选择作用

【自主学习】

1.筛选菌株

(1)自然界中目的菌株的筛选

①原理：根据目的菌株对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。

②实例：能产生耐高温的Taq DNA聚合酶的Taq细菌就是从热泉中筛选出来的。

(2)实验室中目的菌株的筛选

①原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。

②实例：从土壤中筛选能分解尿素的细菌。

③方法：利用选择培养基进行微生物的筛选。

2.选择培养基

(1)概念：允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。

(2)举例：筛选土壤中分解尿素的细菌的选择培养基是以尿素为唯一氮源，按物理性质归类为固体培养基。

【问题探究】

1.筛选分解尿素的细菌的选择培养基

下面是本课题使用的培养基的配方，请分析：

KH2PO4

Na2HPO4

MgSO4·7H2O 葡萄糖

1.4 g 2.1 g 0.2 g 10.0 g

尿素

琼脂

1.0 g 15.0 g

将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1 000 mL

(1)在培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是什么物质？

答案

碳源是葡萄糖，氮源是尿素。

(2)分离分解尿素的细菌的选择培养基是如何进行选择的？

答案

该选择培养基的配方中，尿素是培养基中的唯一氮源，因此，只有能够利用尿素的微生物才能够生长。

(3)为什么只有能分解尿素的微生物才能在该培养基上生长？

答案

分解尿素的微生物能合成脲酶，而脲酶可将尿素分解成氨，从而为微生物提供氮源。

2.设计对照实验

(1)如何设计对照实验验证该选择培养基的确筛选到了能分解尿素的细菌？

答案

增设牛肉膏蛋白胨基础培养基并进行涂布平板操作，如果牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数明显多于选择培养基上的菌落数，则说明选择培养基的确起到了筛选能分解尿素的细菌的作用。

(2)如何设计对照实验验证所用的选择培养基没有受到污染？

答案

设置一个未涂布平板的能筛选分解尿素的细菌的选择培养基。

二、进行微生物数量的测定

【自主学习】

1.统计菌落数目

(1)方法：活菌计数法、显微镜直接计数法。

(2)统计依据：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。

(3)操作

①设置重复组，增强实验的说服力与准确性。

②为保证结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数。

③统计的菌落数往往比活菌实际数目低。

(4)计算公式：每克样品中的菌株数＝(C÷V)×M，其中C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)，M代表稀释倍数。

2.设置对照

(1)对照实验：是指除了被测试条件以外，其他条件都相同的实验。

(2)主要目的：排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。例如，为了确认培养基是否被杂菌污染，需以不进行接种的培养基培养作为空白对照。

3.实验操作流程

(1)土壤取样

①取样原因：土壤有“微生物的天然培养基”之称，同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，种类最多。

②土壤要求：富含有机质，pH接近中性且潮湿。

③取样部位：距地表约3～8 cm的土壤层。

(2)样品稀释

①稀释原因：样品的稀释程度直接影响平板上生长的菌落数目。

②稀释标准：选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得菌落数在30～300之间，便于计数。

(3)微生物的培养与观察

①培养：根据不同微生物的需要，控制适宜的培养温度和培养时间。

②观察

a.观察方法：每隔24 h统计一次菌落数目，最后选取菌落数目稳定时的记录作为结果。

b.菌落的特征：包括菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等。

(4)菌种鉴定

①原理：细菌合成的脲酶将尿素分解成氨，使培养基的碱性增强。

②方法：以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌后，若指示剂变红，可初步鉴定该种细菌能够分解尿素。

4.操作提示

(1)无菌操作

①取土样的用具在使用前都需要灭菌。

②实验操作均应在火焰旁进行。

(2)做好标记：本实验使用的平板和试管比较多，为避免混淆，使用前应标明培养基的种类、培养日期以及平板上培养样品的稀释度等。

(3)制定计划：对于耗时较长的生物实验，要事先制定计划，以便提高工作效率。

【问题探究】

1.统计菌落数目

甲、乙两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。

(1)甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230，该同学的统计结果是否真实可靠？为什么？

答案

不真实。为增加实验的说服力与准确性，应设置重复实验，在同一稀释度下涂布3个平板，统计结果后计算平均值。

(2)乙同学在该浓度下涂布了3个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学将21舍去，然后取平均值。该同学对实验结果的处理是否合理？为什么？

答案

不合理。微生物计数时，如果实验中出现重复实验的结果不一致的情况，应分析实验过程中可能的影响因素，找出差异的原因，而不能简单地舍弃后进行计数。

2.对照实验设计的分析

分析教材P22“设置对照”中的实例，探讨下列问题：

(1)在A同学确定自己操作无误的情况下，A同学得出的菌落数多于其他同学的原因可能有哪两种？

答案

可能是他选择的土壤样品不同于其他同学；也可能是培养基受到了污染或操作失误。

(2)如何设计对照实验帮助A同学排除上述两个可能影响实验结果的因素？

答案

①其他同学用与A同学一样的土样进行实验，如果结果与A同学一致，则证明A同学操作无误；如果结果不同，证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题；②将A同学配制的培养基在不加土样的情况下培养作为空白对照，以判断培养基是否受到污染。

3.下面是土壤中尿素分解菌的分离与计数的实验流程示意图，请结合教材提供的资料分析回答下列问题。

1）.试写出分离土壤中分解尿素的细菌的实验流程

答案

土壤取样→样品稀释→取样涂布→微生物培养→观察并记录结果→细菌计数。

2）.统计菌落数目

甲、乙两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。

(1)甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230，该同学的统计结果是否真实可靠？为什么？

答案

不真实。为增加实验的说服力与准确性，应设置重复实验，在同一稀释度下涂布3

个平板，统计结果后计算平均值。

(2)乙同学在该浓度下涂布了3个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学将21舍去，然后取平均值。该同学对实验结果的处理是否合理？为什么？

答案

不合理。微生物计数时，如果实验中出现重复实验的结果不一致的情况，应分析实验过程中可能的影响因素，找出差异的原因，而不能简单地舍弃后进行计数。

(3)某同学在三种稀释度下吸取0.1 mL的菌液涂布平板，统计菌落数，得到以下的数据，试计算1 g样品的活菌数。

平板

稀释度

104

105

106

答案

105的稀释度下取0.1 mL涂布的三个平板上的菌落数在30～300之间，计算其平均值为(212＋234＋287)/3≈244。进一步可以换算出1 g样品中活菌数为(244÷0.1)×105＝2.44×108。

(4)为什么统计的菌落数比活菌的实际数目低？

答案

当两个或多个细菌连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。

4.微生物数量测定的实验设计

(1)为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？

答案

土壤中各种微生物的数量是不同的，为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离。

(2)本实验中应如何统计培养基上生长的菌落数？

答案

每隔24 h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。

(3)实验中的无菌操作主要有哪些？

答案

①培养基、锥形瓶、试管、铲子、信封等，需要进行灭菌。②称取土壤要在火焰旁进行。③稀释土壤溶液的每一步操作都要在火焰旁进行。

归纳总结

分离尿素分解菌操作中的注意事项

1在实验操作中，每个步骤都要注意无菌操作，以防培养基被污染，影响实验效果。

2样品稀释液的最佳浓度为获得每个平板上有30～300个菌落，这个稀释度细菌一般为104、105、106倍稀释液，放线菌一般为103、104、105倍稀释液，真菌一般为102、103、104倍稀释液。

3为排除非测试因素培养基的干扰，实验需设置牛肉膏蛋白胨培养基进行空白对照。

4每一稀释倍数的菌液都至少要涂布3个平板，作为重复实验，求其平均值，若其中有菌平板1 320 212 21 平板2 360 234 23 平板3 356 287 18

落数与其他平板悬殊过大的，需要对该平板重新制作。

【课堂小结】