课题2　多聚酶链式反应扩增DNA片段优秀公开课教案

课题：多聚酶链式反应扩增DNA片段

教学目标：

（一）知识与技能

1、了解PCR技术的基本操作

2、理解PCR的原理

3、讨论PCR的应用

（二）过程与方法

在多聚酶链式反应扩增DNA片段的实验过程中，应避免外源DNA污染，严格控制温度等反应条件

（三）情感、态度与价值观

通过对PCR实验的操作及结果分析，培养学生严谨的科学态度和实事求是的科研精神

教学重点：PCR的原理和PCR的基本操作

教学难点：PCR的原理

教学过程：

（一）引入新课

DNA技术在刑侦案件中对破案有关键作用。而分析DNA碱基序列，就需要一定量的DNA片段。怎样迅速获得足够量的DNA片段呢？今天我们来研究学习DNA分子的扩增技术――PCR技术。

（二）进行新课

1．自主学习

（1）、回顾DNA在细胞内复制需要的条件及复制的大概过程。

（2）、PCR反应与细胞内DNA复制有何异同？

（3）、3′端、5′端分别是什么基团的末端？

（4）、DNA的合成方向总是怎样的？

（5）、DNA如何在体外将双链打开？

（6）、什么叫DNA的变性和复性？怎样实现？

（7）、PCR反应中需要什么聚合酶？

（8）、PCR反应需要提供的物质及条件是什么？

（9）、PCR反应三部曲？

1．2 细胞内DNA复制过程

解 旋：解旋酶、ATP，DNA两条链打开，，形成两条DNA单链。

引物结合：在DNA单链3’端与DNA反向配对结合，确保引物3’端与DNA单链准确配对。

DNA聚合酶结合：

子链合成：DNA聚合酶从引物3’端开始，将配对的脱氧核苷酸连接起来。

后续加工：DNA聚合酶I将引物切去，并合成空缺处的DNA单链，再由DNA连接酶将不连续的DNA子链连接起来（半不连续合成。先导链，滞后链）

子链合成特点：不能从头合成；合成方向为“5’→3’合成”。

感悟生命的神秘：DNA聚合酶不但能够催化磷酸二酯键的形成，还具有校对功能。它在每引入一个核苷酸后都要复查一次，只有碱基配对无误后才能继续往下聚合，它不能从头合成。RNA聚合酶没有校对功能，因此RNA的合成不需要引物，而是从头合成的，它的错配可能性较大，在RNA引物完成功能后即被DNA聚合酶I删去，代之以高保真的DNA链。

［思考］DNA分子能准确复制的原因有哪些？

DNA双螺旋结构提供模板；碱基互补配对；DNA聚合酶的复查功能。

［思考］细胞内哪些物质是从头合成的？RNA合成、蛋白质合成。

1．3 PCR扩增的原理及条件

解开螺旋：在80～100℃时，DNA双螺旋打开，形成两条DNA单链，称为变性。

恢复螺旋：在50℃左右时，两条DNA单链重新形成双螺旋结构，称为复性。

复制条件：缓冲液,DNA模板,四种脱氧核苷酸,热稳定DNA聚合酶,两种引物。

反应场所：PCR仪（自动温度周期性调节）。

［思考］缓冲液相当细胞内的什么成分？（核基质）1．4PCR的反应过程

变性

复性

延伸

变性：在95℃时DNA解旋

复性：在50℃时引物与DNA单链结合

延伸：在72℃时合成DNA子链（两个引物间的序列）

1.4 PCR反应与体内DNA复制的异同比较

1.5 PCR反应三部曲详解

2．实验操作

2．1 PCR反应体系：缓冲液、DNA模板，四种脱氧核苷酸原料、热稳定DNA聚合酶、两种RNA引物，水

2．2 实验操作步骤

2．3 按照PCR反应体系配方配制反应液；

（2）将PCR反应体系50μL用微量移液器转移到微量离心管（0.5mL）中；

（3）将微量离心管放到PCR仪中；

（4）设置PCR仪的工作参数。

（5）DNA在PCR仪中大量扩增。

2．4 水浴法：将微型离心管依次在95℃、55℃、72℃的恒温水浴锅中循环处理相应时间。

3．实验注意事项

3．1避免外源DNA污染：所用仪器、缓冲液、蒸馏水等使用前高压灭菌。

3．2缓冲液和酶分装成小份，－20℃低温保存。

3．3每添加一种反应成分，更换一个移液器的枪头。

3．4混匀后离心处理，使反应液集中在离心管底部。

4．结果分析与评价

4．1反应液稀释：取2µLPCR反应液，添加98µL蒸馏水；2．分光光度计调零：将100µL蒸馏水添加到比色杯中，在260nm处将分光光度计调整读数为零。

4．2将100µL反应稀释液倒入比色杯中，测定在260nm处的光吸收值。

4．3计算：DNA含量＝50×光吸收值×稀释倍数

（三）课堂总结、点评

DNA的复制需要酶、原料、能量、引物

多

PCR原理

聚DNA的变性和复性受温度影响

酶链

式PCR过程

变性

复性

延伸

反应

扩操作步骤

移入离心管

配制PCR反应体系

增DNADNA扩增

测定含量

稀释

设置工作参数

调零

放入PCR 计算

片段测定并读数

（四）随堂练习

1 标准的PCR过程一般分为变性、复性、延伸三大步，这三大步需要的温度依次是A ) A．92℃、50℃、72℃ B．72℃、50℃、92℃

C．50℃、92℃、72℃ D．80℃、50℃、72℃

2．PCR技术中，引物的作用是( C ) A．打开DNA双链

B．催化合成DNA子链

C．使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始复制

D．提供模板

3．在PCR实验操作中，下列说法不正确的是( A ) A．在微量离心管中添加各种试剂时，只需一个枪头B．离心管的盖子一定要盖严，防止液体外溢

C．用手轻弹离心管壁的目的是使反应液充分混合

D．离心的目的是使反应液集中在离心管部，

提高反应效果

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