课题3　血红蛋白的提取和分离优质课教案推荐

课题3血红蛋白的提取和分离 一、课题目标

1.知识目标

a.说出从血液中初步获取血红蛋白的原理和方法。

b.说明凝胶色谱法的原理和方法。

c.说出电泳的基本原理和方法。

2.能力目标

运用凝胶色谱法对血红蛋白进行分离纯化。

3.情感目标

通过运用凝胶色谱法对血红蛋白进行分离纯化，锻炼科学的思维方法，培养实事求是的科学态度。

二、课题重点

凝胶色谱法的原理和方法。

三、课题难点

样品的预处理；色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。

四

教学流程

教学流程

环节一：课程导入

组时代。对蛋白质的研究与应用，首先需要获得纯度较高的蛋白质。因此，从复杂的细胞混合物中提取、分离高纯度的蛋白质是生物科学研究中经常要做的工作。

课题目标

1.说出从血液中初步获取血红蛋白的原理和方法；

2.说明凝胶色谱法的原理和方法；

3.说出电泳的基本原理和方法；

蛋白质是生命活动不可缺少的物质。随着人类基因组计划的进展以及多种生物基因组测序工作的完成，人类跨入了后基因组和蛋白质展示课题背景，导入课题目标。

课题背景

教师活动

学生活动

设计意图

阅读、情景导入倾听。

本节目标。

4.运用凝胶色谱法对血红蛋白进行分离纯化。

环节二：讲授新课

一、基础知识

（一）蛋白质提取与分离的依据

引导学生回忆蛋白质的物理化学性质，指出其是蛋白质提取与分离的依据。

回答。

质提取与分离的依据。

1.分子的形状、大小 2.电荷性质和多少 3.溶解度 4.吸附性质 5.对其他分子亲和力 （二）方法及原理

概述蛋白质分离的两种常用方法和原理，再分别详细讲解。

凝胶色谱法：根据相对分子质量的大小分离蛋白质

电泳法：根据分子带电性质的差异以及分子本身大小、形状的不同分离蛋白质 1.凝胶色谱法 （1）材料：凝胶

展示图解，讲解种类和特点。

多孔性，多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。

（2）原理：指导学生观察教材图5-13凝胶色谱法分离蛋白质的原理，讲解分离过程。

回忆、说出思考、蛋白观察、说明倾听、凝胶思考。

色谱

法的原理和方法。

步骤：混合物上柱→洗脱→大分子流动快、小分子流动慢→收集大分子→收集小分子

原理：当相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢；

相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。

2.缓冲溶液

联系血液缓冲对物质相关知识，讲解缓冲溶液的概念、作用、配制。

(1)概念：在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液pH发生明显变化的溶液。

(2)作用：能够抵制外界的酸或碱的对溶液的pH的影响，维持pH基本不变。

(3)配制：通常由1－2种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同pH范围内使用的缓冲液。

由弱酸和相应的强碱弱酸盐溶解于水中。如H2CO3/NaHCO3，NaH2PO4/Na2HPO4等。

(4)本实验使用的是磷酸缓冲液(NaH2PO4 /Na2HPO4 ),目的是利用缓冲液模拟细胞内的pH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察（红色）和科学研究（活性）。 3.电泳法

讲解电泳法的概念、原理和类型。

（1）概念：指带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。

（2）原理：分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。 （3）类型： 琼脂糖凝胶电泳法：由于琼脂糖本身不带电荷，各种分子在电场中

回忆、

思考、

回答。

说出缓冲溶液的作用和配制。

阅读、

倾听、

思考、

回答。

迁移速度决定于所带电荷性质的差异及分子的大小、形状的不同

。

演练、

聚丙烯酰胺凝胶电泳法：在凝胶中加入SDS，使蛋白质解聚成单链，作答。

说出与各种蛋白质形成蛋白质－SDS复合物，使其迁移速度完全取决于分子的大小。 【典型例题】 已知某样品中存在甲、乙、丙、丁、戊五种蛋白质分子，其相对分子质量大小、电荷的性质和数量情况如下图所示，下列有关蛋白质分离的叙述正确的是（ ）

电泳的基本原理和方法。

A. 分子甲与分子乙所带电荷性质不同

B. 若用凝胶色谱柱分离样品中的蛋白质，则分子甲移动速度最慢

C. 若将样品以2 000 r/min的速度离心10 min，分子丁存在于沉淀中，则分子甲也一定存在于―沉淀中

D. 将样品装入透析袋中透析12 h，若分子丙保留在袋内，则分子乙也一定保留在袋内

【答案】B 二、实验操作

概述实验操作的基本步骤：样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定。

（一）样品处理

结合课件相关图解讲解样品处理基本步骤。

（1）红细胞的洗涤：

①目的：去除杂蛋白。

②为防止血液凝固，应先加入柠檬酸钠。

③所用洗涤液：是五倍体积的生理盐水（质量分数为0.9%的NaCl溶液）。

④缓慢搅拌，采用低速短时间离心。 ⑤洗涤干净的标准是上清液没有黄色。

（2）血红蛋白的释放：在蒸馏水和甲苯的作用下，红细胞破裂，释放出血红蛋白。

（3）分离血红蛋白溶液：（方法）离心。

试管中的溶液分为4层，从上往下依次是：

①无色透明的甲苯层。 ②白色薄层固体：脂溶性物质沉淀层。

③红色透明液体：血红蛋白溶液层。

阅读、

观察、

倾听、

思考、

回答。

运用凝胶色谱法对血红蛋白进行分离纯化。

④暗红色沉淀层：红细胞破碎物沉淀。

（4）透析：

①方法：取1mL血红蛋白溶液装入透析袋，将透析袋放入盛有300mL

物质的量浓度为20 mmol/L磷酸缓冲液（pH为7）中，透析12h。

②目的：去除样品中分子量较小的杂质。

③原理：透析袋能使小分子自由进出，而将大分子物质保留在袋内。

（二）凝胶色谱操作

指导学生阅读教材相关图解，讲解凝胶色谱操作步骤。

1.凝胶色谱柱的制作 指导学生观察教材图5－19，讲解制作步骤：打孔→挖穴→安管→覆网→纱包→插管

。

2.凝胶色谱柱的装填

①材料：实验所用凝胶是交联葡聚糖凝胶。

②方法：凝胶用蒸馏水充分溶胀后，配成凝胶悬浮液，一次性缓慢倒入色谱柱内。不能有气泡存在。然后用300mL物质的量浓度为20 mmol/L磷酸缓冲液充分洗涤平衡12h，使凝胶装填紧密。 3.样品的加入和洗脱

使吸管管口沿管壁将样品缓慢加入色谱柱内，不要破坏凝胶面。待红色的蛋白质接近色谱柱低端时，用试管收集流出液，每5mL收集一管，连续收集。

【典型例题】 下列有关血红蛋白的提取与分离的实验操作的叙述，正确的是（ ）

A. 分离红细胞时采用低速长时间离心

B. 红细胞释放出血红蛋白只需要加入蒸馏水即可

C. 分离血红蛋白溶液要低速短时间离心

D. 透析时要用20 mmol/L的磷酸缓冲液，透析12 h 【答案】D 以下关于猪血红蛋白提纯的描述，不正确的是（ ）

A．洗涤红细胞时，使用生理盐水可防止红细胞破裂

B．猪成熟红细胞中缺少细胞器和细胞核，提纯时杂蛋白较少

演练、作答。

C．血红蛋白的颜色可用于凝胶色谱法分离过程的监测

D．在凝胶色谱法分离过程中，血红蛋白比分子量较小的杂蛋白移动慢

【答案】D 三、操作提示 提醒学生关注几个方面的操作提示。

1.红细胞的洗涤：

洗涤次数不能过少；低速、短时离心。 2.色谱柱的装填：

装填尽量紧密，降低颗粒间隙；无气泡；洗脱液不能断流。 3.凝胶的预处理：

沸水浴法时间短，还能除去微生物和气泡。 4. 色谱柱成功标志：

红色区带均匀一致地移动。

四、结果分析与评价

讲解几个方面的结果分析与评价。

1.血液样品的处理：分层明显→样品处理完成 2.凝胶色谱柱的装填：放一支与凝胶柱垂直的入大分子有色物质如蓝色葡聚糖—2000或红色葡聚糖，若色带均匀、狭窄、平整→装填成功。 3.血红蛋白的分离 血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随洗脱液缓慢流出，分离成功。