课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数教学设计思路

姓名：______________

学生班级：_____________________

组别：_____________________ 北滘中学2016-2017学年

第二学期

高

二

年级

___生物_科

第

3 周

导学案周编号

1

导学案学期总编号5

主编教师

李正平

审核人_______________________________

专题2微生物的培养与应用 课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

学习目标：1．研究培养基对微生物的选择作用；

2．进行微生物数量的测定。

学习难点:

对分解尿素的细菌的计数。

学习重点:

对土样的选择和选择培养基的配置

课

堂

探

究

案

一、

筛选菌株的思路及统计菌落数目的方法

（一）

筛选菌株的思路

1、

自然界中的目的菌株的筛选：

（1）依据：根据它对

的要求，到相应的环境中去寻找。

（2）实例：PCR技术过程中用到的耐高温的

，就是从热泉中筛选出来的tap细菌中提取出来的。

2、实验室中的目的菌株的筛选

（1）原理：人为提供有利于

生长条件（包括营养、温度、PH等），同时

的生长。

（2）方法：利用选择培养基分离

①选择培养基：

②实例：

加减成份

加青霉素等抗生素

加高浓度食盐水

不加氮源（无氮培养基）

分离菌种

不加碳源（无碳培养基）

以尿素为唯一氮源

以纤维素为唯一碳源

（二）

统计菌落数目

1、

常用方法：

（1）原理：①当样品的

足表面够高时，培养基表面生长出

，来源于稀释培养液中的

。

②通过统计平板上的

来推测样品中大约有的活菌数。

1

（2）计算公式：

=（C÷V）×M C：代表某一稀释度下平板上生长的

M：代表涂布平板时所用的

（ml），

M代表

（3）注意事项：

①为了保证结果的准确，每个稀释度，一般设置

，选择菌落在30—300的平板进行计数，并取

[来源:Zxxk.Com]

②统计的菌落数往往要比活菌的实际数目

，原因是当两个或多个细胞连在一起，平板上观察到的只是

，因此，统计结果一般用

，而不用

③设置对照：主要目的是排除实验组中

对实验结果的干扰，提高实验结果的可信度。

2、其他方法：

直接计数

3、两种常用的计数方法比较

主要用具

计数依据

优点

缺点

计算公式

显微镜、

菌株本身

计数方便、操作简单

死菌活菌都计算在内

间接计数

培养基

培养基上

计数都是活菌

操作复杂，有一定误差

[来源学科网]

二、实验设计及操作提示

（一）实验设计

1、土壤取样：（1）土壤要求：富含

，PH接近中性且潮湿（2）取样要求：距离地面

的土壤层。

2、制备培养基：准备

，

制备9个平板培养基。

3、样品稀释：（1）稀释原因：样品稀释程度直接影响平板上生长的菌落数目。（2）稀释标准：选用一定稀释范围的样品液进行培养，保证获得的菌落数在

，便于计数。（3）稀释倍数：测定土壤中

的

的数量，一般选用

；测定

的数量，一般选用

；测定真菌的数量，一般选用

。

4、涂布平板：（1）在上述培养基中的9个平板地面，每三个一组分别记号104、105和106倍三种稀释液。

2

（2）

用三支1ml无菌吸管分别从104、105和106倍的三管土壤稀释液中吸取0.1ml

对号放入已写好稀释度的平板，用无菌涂布器在培养基表面上轻轻涂布均匀。

5、培养观察：（1）培养：不同种类微生物，需要不同的培养

和培养

。

（2）观察：每隔24小时统计一次菌落数目，最后选取

时的记录为结果。

6、计数：当菌落数目稳定时，取同一稀释度下的3个平板计数，求出

并根据对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。

（二）操作提示

1、无菌操作[来源:Z§xx§k.Com]

（1）去土壤的用具在使用前需要

（2）应在

，并在火焰附近将称好的土样倒入锥形瓶，塞好

（3）在稀释土壤样液的过程中，每一步都在

操作

2、做好标记：

本实验使用的平板和试管比较多，为避免混淆，最好使用前就做好

（1）培养皿的标记：注明培养基的种类、培养日期以及平板上培养样品的

等

（2）试管标记：将已经进行过稀释操作的试管，按

的顺序，依次放在试管架的另一行。

3、制定计划：对于耗时较长的生物实验，事先要

，以便提高工作效率。

（三）菌种鉴定

1、原理：分解尿素的细菌合成的

将尿素分解为

，使培养基的

增强。

2、方法：在以

的培养基中加入

指示剂培养细菌，若指示剂变

，初步鉴定该种细菌能够分解尿素。

三、实验结果分析与评价：

内容

判断有无杂菌污染[来源:Z&xx&k.Com]现象

对照的培养皿中无菌落生长[来源:Z§xx§k.Com]结论

培养基灭菌彻底

培养基混入其他杂菌

菌落形态多样，菌落数偏高

选择培养基的筛选作用

牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目

选择培养基具有

选择培养基上的菌落数目

作用

操作成功

样品的稀释操作

得到3个或3个以上菌落数目在

30—300的平板

3

重复组的结果

若选取同一种土样，统计结果应

例题分析

【例1】下列是关于检测土壤中细菌总数实验操作的叙述,其中错误的是(

) A.用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基,经高温、高压灭菌后倒平板

B.取104、105、106倍的土壤稀释液和无菌水各0.1 mL,分别涂布于各组平板上

C.将实验组和对照组平板倒置,37 ℃恒温培养24~48 h D.确定对照组无菌后,选择菌落数在300以上的实验组平板进行计数

【例2】

测定土壤中细菌的数量一般选用104、105和106倍的稀释液进行平板培养,而测定真菌的数量一般选用102、103和104倍稀释。其原因是(

) A.细菌个体小,真菌个体大

B.细菌易稀释,真菌不易稀释

C.细菌在土壤中的数量比真菌多

D.随机的,没有原因

【例3】

微生物需要从外界吸收营养物质并通过代谢来维持正常的生长和繁殖,下列与此有关的说法,正确的是(

) A.以尿素为唯一氮源的培养基上长出的一定是能分解尿素的细菌

B.有的氮源可以作为细菌的能源物质

C.加入酚红试剂的选择培养基,可以筛选能分解尿素的细菌

D.大肠杆菌与硝化细菌所利用的碳源是相同的

【例4】下面是分离分解尿素的细菌所用的培养基，据表回答下列问题。

（1）该培养基中含有的碳源是________________。该培养基除了能够提供碳源外，还可以提供

。

（2）该培养基按物理性质划分属于___________培养基，该培养基具有选择作用的原因是________________________________________________。

（3）在该培养基中，可以通过检测pH的变化来判断尿素是否被分解，所依据的原理是______________________________________________________。方法是在培养基中加入___________，若尿素被分解，则培养基变成_______色。

（4）如果将此培养基改为用来培养分离分解纤维素的微生物的培养基，则提供碳源的物质应改为________________。

4

土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

巩固练习

1.可以鉴定出分解尿素的细菌的方法是(

) A.以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂

B.以尿素为唯一氮源的培养基中加二苯胺试剂

C.以尿素为唯一氮源的培养基中加入苏丹Ⅲ试剂

D.以尿素为唯一氮源的培养基中加入双缩脲试剂

2.关于微生物的培养,下列叙述错误的是(

) A.细菌一般在30~37 ℃的温度下培养1~2 d

B.放线菌一般在25~28 ℃的温度下培养5~7 d C.霉菌一般在25~28 ℃的温度下培养3~4 d D.不同种类的微生物,一般需要相同的培养温度和培养时间

3.

在培养基中加入尿素(唯一氮源),以分离出能分解尿素的细菌,这种加入尿素的培养基在功能上属于(

) A.选择培养基

B.固体培养基

C.液体培养基

D.半固体培养基

4.需要在火焰旁操作的有(

) ①土壤取样

②称取土壤

③稀释土壤溶液

④涂布平板

⑤微生物的培养

A.①②③④⑤

B.②③④⑤

C.③④⑤

D.②③④

5.下列不属于统计菌落数目方法的是(

) A.显微镜直接计数法

B.活菌计数法

C.滤膜法 D.标志重捕法

6.以下关于分解尿素的细菌的说法,正确的是(

) A.能分解尿素的原因是能合成分泌蛋白酶

B.以尿素作为唯一的碳源

C.环境中含有大量的尿素诱导该细菌产生了分解尿素的特性

D.以尿素为唯一氮源且添加了酸碱缓冲剂的培养基培养该菌后不会使酚红指示剂变红

7.稀释涂布平板法分离分解尿素的细菌时使用的涂布器应保存在体积分数为70%的酒精中,取出后又要放在酒精灯火焰上引燃,这两步分别属于什么技术? A.灭菌、灭菌

B.消毒、消毒

C.灭菌、消毒

D.消毒、灭菌

(

) 8.通常用来作为菌种鉴定的重要依据是(

) A.菌落

B.细菌形态

C.细菌体积

5 D.细菌结构

9.下列关于微生物分离和培养的叙述,错误的是(

) A.微生物培养前,需对培养基进行消毒

B.测定土壤样品中的细菌数目,常用菌落计数法

C.分离土壤中不同的微生物,要采用不同的稀释度

D.分离能分解尿素的细菌,要以尿素作为培养基中唯一氮源

10.测定土壤中不同微生物的数量,要选用不同倍数的稀释液进行平板培养,请选出培养细菌时所用的稀释倍数(

) ①102

②103

③104

④105

⑤106

A.①②③

B.②③④

C.③④⑤

D.①④⑤

11.实验测定链霉素对3种细菌的抗生素效应,用3种细菌在事先准备好的琼脂平板上画3条等长的平行线(3条线均与图中的链霉素带接触),将平板置于37 ℃条件下恒温培养3天,结果如下图所示。从实验结果分析,以下叙述不正确的是(

) A.链霉素能阻止结核菌的生长

B.链霉素对结核菌比对霍乱菌更有效

C.链霉素对结核菌比对伤寒菌更有效

D.链霉素可以用于治疗伤寒病人

12.下列有关土壤中微生物的分离与计数的说法,错误的是A.因为土壤中各类微生物的数量不同,所以,为获得不同类型的微生物要按不同的稀释倍数进行分离

B.测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量,选用的稀释范围不同

C.如果得到了3个或3个以上菌落数目在30~300的平板,则说明稀释操作比较成功,并能够进行菌落的计数

D.牛肉膏蛋白胨培养基的菌落数目明显小于选择培养基的数目,说明选择培养基已筛选出一些细菌菌落

13.马丁培养基是实验室常用的培养基之一。下表为马丁培养基的化学成分,据此回答下列问题。

成分

KH2PO4·3H2O MgSO4·7H2O 0.1%孟加拉红溶液

2%去氧胆酸钠溶液

链霉素溶液(1×104

μ/mL) 含量

0.1 g 0.05 g 0.33 mL 2 mL 0.33 mL 成分

葡萄糖

蛋白胨

琼脂

H2O —

含量

1 g 0.5 g 1.5~2 g 100 mL

6

(1)该培养基中加入了链霉素,能抑制细菌和放线菌,但真菌可以在上面生长,因此培养基是一种

培养基。 (2)葡萄糖能给微生物生长提供

和

。 (3)蛋白胨能给微生物生长提供

和

。 (4)培养基中KH2PO4·3H2O可给微生物提供含

的无机盐。 (5)琼脂的作用是作为

。 14.探究如何从土壤中分离自生固氮菌并计数。

实验原理:农田的表层土壤中,自生固氮菌的含量比较多。将用表层土制成的稀泥浆,接种到无氮培养基上进行培养。在这种情况下,只有自生固氮菌才能生长繁殖。

材料用具:农田的表层土壤、无氮培养基、牛肉膏蛋白胨培养基、盛9 mL无菌水的大试管若干、无菌移液管、无菌涂布器、无菌培养皿、盛90 mL无菌水的锥形瓶、酒精灯、恒温箱。

方法步骤: (1)倒平板。分别将无氮培养基、牛肉膏蛋白胨培养基倒平板,应在

操作。 (2)制备土壤稀释液。取土样10 g加入盛有90 mL无菌水的锥形瓶中,充分摇匀。用无菌移液管吸取上清液

1 mL,转至9 mL无菌水的大试管中,依次稀释到107倍稀释度。为实现无菌操作,试管口和移液管应在离火焰

cm处。 (3)涂布。按照由103~107稀释度的顺序分别吸取0.1 mL进行平板涂布,每个稀释度下,无氮培养基应至少涂布

个平板,牛肉膏蛋白胨培养基涂布

个平板。 (4)培养。放入恒温箱内,在适宜温度条件下培养3~4 d。一般每隔

h统计一次,选取

时的记录作为结果,这样可以防止

。 (5)细菌的计数。当菌落数目稳定时,选取菌落数在

的平板进行计数。如果统计的平均值为50,则每克样品中的菌株数是

(稀释度是105)。 (6)预期结果。相同稀释度下,牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数

(填“多于”或“少于”)无氮培养基上的数目。理由是

。 15.某化工厂的污水池中,含有一种有害的、难以降解的有机化合物A。研究人员用化合物A、磷酸盐、镁盐以及微量元素配制的培养基,成功地筛选到了能高效降解化合物A的细菌(“目的菌”)。请分析回答下列问题。

(1)培养基中加入化合物A的目的是筛选

,这种培养基属于

培养基。

7

(2)“目的菌”生长所需的氮源和碳源是来自培养基中的

,实验需要振荡培养,由此推测“目的菌”的代谢类型是

。 (3)培养若干天后,应选择培养瓶中化合物A含量

的培养液,接入新的培养液中连续培养,使“目的菌”的数量

。 (4)可采用

的方法将“目的菌”接种到固体培养基上,通过

法对“目的菌”的数量进行统计,通常需要对菌落数为

的平板进行计数。 (5)实验结束时,使用过的培养基应该进行

处理后,才能倒掉。 学案填空答案：

（一）1、（1）生存环境

（2）

Taq DNA聚合酶

2、（1）目的菌株

抑制或阻止其他微生物

（2）①允许特定的微生物生长，同时阻止或抑制其他种类微生物生长的培养基

②真菌

金黄色葡萄球菌

固氮微生物

尿素分解菌

纤维素分解菌

（二）1、稀释涂布平板法

（1）①稀释度

一个菌落

一个活菌

②菌落数

（2）每克样品中的菌落数

平均菌落数

稀释液的体积

稀释倍数

（3）三个平板

平均值

低

一个菌落数

菌落数

活菌数

非测试因素

2、显微镜（血球计数板）直接计数

3、直接计数

稀释涂布平板法

血球计数板

菌落数

公式略

二、（一）1、有机质

2、选择培养基

以尿素为唯一氮源

3、30-300

细菌

104、105和106倍的稀释液

放线菌

103、104和105倍的稀释液

102、103和104倍三种稀释液

5、温度

时间

数目稳定

6、平均值

（二）1、灭菌

酒精灯火焰旁称取土壤

棉塞

酒精灯火焰旁

2、标记

稀释度

稀释度递增

3、制定计划

（三）大于

筛选

30-300

相近

【例1】答案:D【例2】答案:C【例3】答案:B

【例4】4、（1）葡萄糖

氮源、水和无机盐

（2）固体

该培养基中唯一的氮源是尿素，只有能分解尿素的微生物才能生长繁殖

（3）在分解尿素的过程中，微生物产生的脲酶能将尿素分解成氨，氨会使培养基的PH升高

酚红指示剂

红

纤维素

8

巩固练习答案

答案:A答案:D答案:A答案:D答案:D

答案:D答案:D答案:A答案:A答案:C 答案:D答案:D 13答案:(1)选择

(2)碳源

能源

(3)氮源

维生素

(4)K、P

(5)凝固剂

14答案:(1)酒精灯火焰旁

(2)1~2

(3)3

1 (4)24

菌落数目稳定

因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目

(5)30~300

5×107

(6)多于

无氮培养基上可以生存和繁殖的只是土壤中的自生固氮菌,而牛肉膏蛋白胨培养基上几乎允许土壤中所有菌类的生存

15答案:(1)“目的菌”

选择

(2)化合物A

异养需氧型

(3)减少

增加

(4)稀释涂布平板

活菌计数

30~300

(5)灭菌

巩固练习答案

答案:A答案:D答案:A答案:D答案:D

答案:D答案:D答案:A答案:A答案:C 答案:D答案:D 13答案:(1)选择

(2)碳源

能源

(3)氮源

维生素

(4)K、P

(5)凝固剂

14答案:(1)酒精灯火焰旁

(2)1~2

(3)3

1 (4)24

菌落数目稳定

因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目

(5)30~300

5×107

(6)多于

无氮培养基上可以生存和繁殖的只是土壤中的自生固氮菌,而牛肉膏蛋白胨培养基上几乎允许土壤中所有菌类的生存

15答案:(1)“目的菌”

选择

(2)化合物A

异养需氧型

(3)减少

增加

(4)稀释涂布平板

活菌计数

30~300

(5)灭菌

巩固练习答案

答案:A答案:D答案:A答案:D答案:D

答案:D答案:D答案:A答案:A答案:C 答案:D答案:D 13答案:(1)选择

(2)碳源

能源

(3)氮源

维生素

(4)K、P

(5)凝固剂

14答案:(1)酒精灯火焰旁

(2)1~2

(3)3

1 (4)24

菌落数目稳定

因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目

(5)30~300

5×107

(6)多于

无氮培养基上可以生存和繁殖的只是土壤中的自生固氮菌,而牛肉膏蛋白胨培养基上几乎允许土壤中所有菌类的生存

15答案:(1)“目的菌”

选择

(2)化合物A

异养需氧型

(3)减少

增加

(4)稀释涂布平板

活菌计数

30~300

(5)灭菌

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