课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数教学实录及点评

课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

一、理论基础

1．筛选菌株

（1）实验室中微生物筛选的原理：人为提供有利于

目的菌株 生长的条件（包括营养、温度、pH等），同时

抑制 或

阻止 其他微生物生长。

经典案例：DNA多聚酶链式反应（PCR）所需的

耐高温

的DNA聚合酶（Taq酶）的发现。

（2）选择培养基：在微生物学中，将允许 特定 种类的微生物生长，同时 阻止 或 抑制 其他种类微生物生长的培养基，称作选择培养基。

2．设置对照

设置对照的主要目的是排除实验组中

非测试因素

对实验结果的影响，提高实验结果的 可信度 。

二、实验设计（参阅课本P24）

三、课题延伸

本课题对能分解尿素的细菌进行初步的筛选，欲作进一步鉴定，可在以 尿素 为唯一氮源的培养基中加入 酚红指示剂

观察能否产生如教材中图2-10的颜色反应。

课题3分解纤维素的微生物的分离

一、基础知识

1．纤维素与纤维素酶

（1）纤维素的化学组成： C、H、O 三种元素，是一种 多 糖。

（2）纤维素的分布： 棉花

是自然界中纤维素含量最高的天然产物，此外，木材、作物秸秆等也富含纤维素。

（3）纤维素酶的作用：纤维素酶是一种

复合酶

，一般至少包括三种组分，即

C1 酶、

Cx

酶和

葡萄糖苷

酶，前两种酶使纤维素分解成

纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。

2．纤维素分解菌的筛选

（1）筛选方法：

刚果红 染色法。

（2）筛选原理：刚果红可以与像纤维素这样的多糖物质形成 红色复合物

，但并不和水解

后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应，当纤维素被纤维素酶分解后，红色复合物无法形成，出现

以 纤维素分解菌 为中心的透明圈，我们可以通过 是否产生透明圈 来筛选纤维素分解菌。

常用的刚果红染色法有两种，一种是先培养 微生物 ，再加入刚果红进行颜色反应，另一种

是在 倒平板 时就加入刚果红。

【探究案】

1.下图为筛选尿素分解菌的培养基配方。请你分析该培养基的配方，想一想这种培养基对微生物是否具有选择作用？培养基上长出的菌落是否一定是尿素分解菌（培养基严格依照配方配制且实验操作科学规范）？

本课题使用的培养基：

KH2P04 1.4 g

Na2HP04 2.1 g

MgS04·7H2O 0.2 g

葡萄糖 10.0 g

尿素 l.0 g

琼脂 l5.0 g

将上述物质溶解后，用自来水定容到l000 mL。

2.如何对土壤样品中尿素分解菌进行计数？怎样确保统计数据准确有效？

【训练案】（限时完成；错题必须用红笔更正并做出简要提示。）

1．微生物与人类关系密切，虽然有些微生物能使动植物患病，但多数微生物对人类是有益的。下表为两种微生物的培养基配方，请回答下列有关问题。

A培养基

KH2P04

1.4 g Na2HP04

2.1 g MgS04·7H2O 0.2 g 葡萄糖

1 0.0 g 尿素

1.0 g 琼脂

15.0 g B培养基

纤维素粉

NaN03

5 g l g Na2HP04·7H2O 1.2 g KH2PO4

MgSO4·7H2O 0.9 g 0.5 g KCl 酵母膏

水解酪素

0.5 g 0.5 g 0.5 g 上述两种培养基中的物质溶解后，均用蒸馏水定容到1000 mL。

（1）如果要进行土壤中分解尿素的细菌的分离，则需要选择上述哪种培养基？

，从功能上看，该培养基属于 培养基。为了确定该培养基起到了选择作用，一般选用 作为对照。

（2）在进行分离分解尿素的细菌的实验时，A同学从培养基上筛选出大约l50个菌落，而其他同学只筛选出大约50个菌落。A同学的实验结果产生的原因可能有 。(填序号) ①由于土样不同 ②由于培养基污染 ③由于操作失误 ④没有设置对照

（3）在该培养基中可加入 指示剂，根据指示剂的颜色可鉴定该种细菌能够分解尿素。食品安全检测时通常采用大肠杆菌作为致病微生物的指示菌，

为测定哪些菌落属于大肠杆菌，可选用 培养基对该菌落进行鉴定，大肠杆菌的菌落在该培养基上呈现 色。

（4）若从土壤中分离自生固氮菌，该培养基成分如何调整？ ，依据是

。

2．有些细菌可分解原油，从而消除由原油泄漏造成的土壤污染。

（1）某同学欲从土壤中筛选出高效降解原油的菌株。土壤样品可来自 ( ) A．森林腐殖土 B．原油污染的土壤 C．耕作田地

（2）据题推测降解原油的细菌属于 （填“自养”或“异养”）生物。

（3）在筛选过程中，应将土壤样品稀释液接种于以 为唯一碳源的固体培养基上。为了筛选出高效菌株，可比较单菌落周围分解圈的大小，分解圈大说明该菌株的降解能力 。欲获得大量原油降解菌，可用（填“固体”或“液体”）培养基扩大培养。

3．有机农药苯磺隆是一种除草剂，长期使用会污染环境。研究发现，苯磺隆能被土壤中某些微生物降解。分离降解苯磺隆的菌株和探索其降解机制的实验过程如图甲、乙所示。

（1）该实验所用的选择培养基只能以苯磺隆作为唯一碳源，原因是 。

（2）纯化菌株时，通常使用的划线工具是 。划线的某个平板培养后，第一划线区域的划线上都不间断地长满了菌，第二划线区域所划的第一条线上无菌落，其他划线上有菌落。造成划线无菌落可能的操作失误有 。

（3）为探究苯磺隆的降解机制，将该菌种的培养液过滤离心，取上清液做图乙所示实验。该实验的假设是 ， 该实验设计是否合理?为什么？

。

4．某些微生物能合成纤维素酶，通过对这些微生物的研究，人们能够利用秸秆等废弃物生产酒精，用纤维素酶处理服装面料等。研究人员用化合物A、硝酸盐、磷酸盐以及微量元素配制的培养基，成功地筛选到能产生纤维素酶的微生物。请分析并回答问题：

（1）培养基中加入的化合物A是 。

（2）甲同学在实验中用刚果红染色法得到了如右图所示的结果，则纤 维素分解菌位于 内。

A．③ 8．①② C．②③ D．①②③

（3）在培养纤维素分解菌的过程中，进行平板划线时，每次划线结束 后仍然要灼烧接种环，原因是 。

（4）某同学打算从牛胃中分离纤维素分解菌并计数，与分离醋酸菌相比．进行培养时除了营养不同外，最主要的实验条件差别是 ，该同学采用活菌计数法统计的菌落数目往往比活菌的实际数目 。

（5）丙同学在提取和分离纤维素酶的过程中，为了保证抵制外界酸和碱对酶活性的影响，采取的措施是向提取液和分离液中添加 ；若探究纤维素酶活性的最适温度，如何设置对照？ 。

5．高温淀粉酶在大规模工业生产中有很大的实用性。研究者从热泉中筛选了高效产生高温淀粉酶的嗜热菌，其筛选过程如下图所示。

（1）①过程称为 ，②过程是为了 。

（2）I号培养基中除了加入淀粉外，还需加入另一种重要的营养成分 。

A．琼脂 B．葡萄糖 C．硝酸铵 D．碳酸氢钠

（3）一般对配制的培养基采用高压灭菌，其中“高压”是为了 。

（4）在高温淀粉酶运用到工业生产前，需对该酶的最佳温度范围进行测定。下图中的曲线①表示酶在各种温度下酶活性相对最高酶活性的百分比。将酶在不同温度下保温足够长的时间，再在酶活性最高的温度下测其残余酶活性，由此得到的数据为酶的热稳定性数据，即下图中的曲线②。

①根据图中的数据，判断该酶使用的最佳温度范围是 。

A．40～50℃ B．50～60℃ C．60～70℃ D．70～80℃

②据图判断下列叙述错误的是 。

A．该酶只能在最佳温度范围内测出活性 B．曲线②表明35℃数据点是在80℃时测得的

C．曲线①表明80℃是该酶活性最高的温度 D．曲线②表明该酶的热稳定性在70℃后急剧下降

【参考答案】

课题l微生物的实验室培养

1．⑤③②①④⑥

2．（1）稀释涂布平板法 灭菌 （2）碳源 氮源 水 无机盐 特殊营养物质 pH 氧气

（3）调节pH 接种

3．（1）牛肉膏、蛋白胨 牛肉膏 （2）比例 用玻棒搅拌 琼脂糊底引起烧杯破裂 （3）高压蒸汽灭菌锅 l21℃ 15～30min 废弃 （4）适量水 （5）外 冷却 4 4．（1）平板划线 稀释涂布（或涂布） （2）涂布

（3）敏感 不敏感 该致病菌对C的敏感性比A的弱 耐药菌 （4）A 75．（1）检测培养基平板灭菌是否合格 3.8×10 （2）灼烧 将聚集的菌体逐步稀释以便获得单个菌落 （3）B （4）溶解氧 营养物质

课题2 .3

1．具有选择作用，尿素作为唯一氮源可以筛选出能够利用尿素氮的细菌。

不一定是尿素分解菌，有可能生长一些能够利用尿素分解后产物的微生物或者一些自生固氮菌，所以还需进一步鉴定。

2．由于土壤样品中可能存在数量繁多的尿素分解菌。

①可用显微镜计数法（类似于血球计数板计数酵母菌的实验）。

②用稀释涂布平板法，通过计数平板的菌落数，根据计算公式就能推断土样中的活菌数。 确保统计数据准确有效可采取：

①设置对照组，确保选择培养基存在选择功能。 ②设置重复实验，求平均值。

【训练案】

1．（1）A培养基 选择 牛肉膏蛋白胨培养基 （2）①②③ （3）酚红 伊红美蓝 黑 （4）不加尿素 自生固氮菌可以固定空气中的氮气满足自身对氮的需求

2．（1）B （2）异养 （3）原油 强 液体

3．（1）只有能利用苯磺隆的微生物能正常生长繁殖 （2）接种环 ①接种环灼烧后未冷却；②划线未从第一区域末端开始 （3）目的菌株能分泌降解苯磺隆的蛋A质 不合理。缺少空白对照

4．（1）纤维素 （2）A （3）及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境

（4）保证无氧环境 小（低） （5）缓冲溶液 设置不同的温度梯度进行相互对照

5．（1）稀释 单个菌落的筛选（或筛选） （2）C （3）杀死培养基中的细菌芽孢

（4）①C ②A

发酵工程是指采用现代工程技术手段，利用微生物的某些特定功能，为人类生产有用的产品，或直接把微生物应用于工业生产过程的一种新技术。发酵工程的内容包括菌种的选育、培养基的配制、灭菌、扩大培养和接种、发酵过程和产品的分离提纯等方面（图5-15）。