课题3　血红蛋白的提取和分离第一课时教学设计

课题3

《血红蛋白的提取和分离》学案

一、知识梳理

1.蛋白质的分离依据

根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和

、所带

的性质和多少、溶解度、

和对其他分子的亲和力等，可以用来分离不同种类的蛋白质。

2.凝胶色谱法

(1)概念：也称做

，是根据

分离蛋白质的有效方法。

(2)凝胶的特点

形态：微小的_________ 组成：大多数由

构成

结构：内部有许多___________ (3)常用凝胶：

或琼脂糖。

(4)分离原理

①相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程

，移动速度

，通过凝胶的时间

。

②相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶_____移动，路程

，移动速度

，通过凝胶的时间

。

3.缓冲溶液

(1)作用：在一定范围内，缓冲溶液能够抵制

对溶液pH的影响，维持pH基本不变。

(2)配制：通常由1～2种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的_____就可以制得

的缓冲液。

(3)意义：为了能够在实验室条件下准确模拟生物体内的过程，保持_____与体内环境中的pH基本一致。

4.电泳

(1)概念：带电粒子在

的作用下发生

的过程。

(2)原理

①带电粒子：许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有

的基团，在一定的pH下，这些基团会带上

。

②迁移动力与方向：在电场的作用下，带电分子会向着与其_____________的电极移动。

③分离依据：电泳利用了待分离样品中各种分子

以及分子本身的

、

的不同，使带电分子产生

，从而实现样品中各种分子的分离。

(3)

常用的电泳方法：

电泳和

电泳。在测定蛋白质分子量时通常使用

。

(4)

琼脂糖凝胶电泳和SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳的区别

①琼脂糖凝胶电泳依据分子所带电荷的差异和分子大小、形状等。

②SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳则完全取决于

，而非电荷性质和分子形状。

5、问题探究

①为什么相对分子质量较大的蛋白质会先从色谱柱中洗脱出来？

②SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质时，电泳迁移率为什么完全取决于分子大小？

二、实验操作

样品的处理——通过

、

、离心等操作收集到血红蛋白溶液

↓

粗分离——经过透析去除

的杂质

↓

纯化——通过凝胶色谱法将

的杂质蛋白除去

↓

纯度鉴定——SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

1.样品处理

(1)红细胞的洗涤

①目的：去除

。

②方法：

。

③标准：直至上清液不再呈现

。

(2)血红蛋白的释放

加入加入红细胞―――――→到原血液的体积―――――――――→磁力搅拌器上搅拌

40%体积的甲苯

min―――――→血红蛋白释放。

(3)

分离血红蛋白溶液

r/min离心

min①方法：混合液――――――――――――――――→分层。

②分层结果(自上而下)：

第1层：无色透明的

。

第2层：脂溶性物质的

——白色薄层固体。

第3层：

的水溶液——

透明液体。

第4层：其他杂质的暗红色沉淀物。

③结果处理：将试管中的液体用

过滤，除去

沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的

液体。

2.透析——粗分离

(1)过程：取1 mL的

溶液装入

中，将其放入盛有300 mL的物质的量浓度为20 mmol/L的

中(pH为7.0)，透析12 h。

(2)原理：透析袋能使

自由进出，而将

保留在袋内。

(3)目的：去除样品中

的杂质。

3.凝胶色谱操作——纯化

(1)凝胶色谱柱的制作

↓

(2)凝胶色谱柱的装填：凝胶用

充分溶胀后，配成凝胶悬浮液，

缓慢倒入凝胶色谱柱内

↓

①加样前：打开流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到与凝胶面

，关闭出口

②加样：用吸管小心地将1 mL透析后的样品加到色谱柱的

，

注意不要破坏凝胶面

③加样后：打开下端出口，使样品渗入

内

(3)样品的加入

↓

(4)洗脱：

下端出口，加入磷酸缓冲液，连接

，_____

下端出口，进行洗脱

4.SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳——纯度鉴定

判断纯化的蛋白质是否达到要求，需要进行

的鉴定。鉴定方法中，使用最多的是

。

5.操作提示

(1)红细胞的洗涤：

、离心速度与

十分重要。洗涤次数过少，无法除去

蛋白；离心速度过高和时间过长会使白细胞等一同沉淀，达不到分离的效果。

(2)色谱柱填料的处理：商品凝胶使用前需直接放在

中膨胀，可以将加入洗脱液的湿凝胶用沸水浴加热，加速膨胀。这种方法不但可以节约时间，而且可以出去凝胶中可能带有的

，排出胶粒内的

。

(3)凝胶色谱柱的装填：在装填凝胶柱时，不得有气泡存在。气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的

，降低

。在凝胶色谱柱的操作过程中，不能发生

，露出凝胶颗粒的现象。一旦发生这种情况，凝胶色谱柱需要

。

(4)蛋白质的分离：如果红色区带

地移动，说明色谱柱制作成功。

6、问题探究

(1)材料的选择：与其他真核细胞相比，哺乳动物成熟红细胞有什么特点？这一特点对你进行蛋白质的分离有什么意义？

（2）在血红蛋白释放过程中，蒸馏水和甲苯的作用分别是什么？

（3）试从凝胶色谱的分离原理分析，凝胶的装填为什么要紧密、均匀？

三、当堂检测

右图表示血红蛋白提取和分离的部分实验装置，请据图分析回答下列问题：

(1)血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分，其在红细胞中的作用体现了蛋白质具有

功能。

(2)甲装置用于

，目的是去除样品中

的杂质，图中A是

。B是

溶液。

(3)用乙装置分离蛋白质的方法叫

，是根据

分离蛋白

质的有效方法。

(4)乙装置中，C是

，其作用是

。

(5)用乙装置分离血红蛋白时，待____________________时，用试管收集流出液，每5 mL收集一管，连续收集6管，图中试管序号表示收集的先后。经检测发现，试管②和试管⑤中蛋白质含量最高，则试管⑤中的蛋白质相对分子质量比血红蛋白

(填“大”或“小”)。