复习与测试优秀教案内容

专题2

微生物的培养与应用

课题一

微生物的实验室培养

一、培养基及无菌技术

（一）培养基

1、概念：人们按照微生物对

的不同需求，配制出的供其

的营养基质。

2、培养基的种类：按物理性质分为

培养基和

培养基，按化学成分分为

培养基和

培养基，按用途分为

培养基和

培养基。

2、培养基的成分一般都含有

。

3、微生物在

培养基表面生长，可以形成肉眼可见的

，是鉴定菌种的重要依据。

（二）无菌操作

1、无菌操作技术的目的是

。主要内容包括：

（1）对实验操作

、操作者的

，进行清洁和消毒。

（2）将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行

。

（3）为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在

附近进行。

（4）实验操作时应避免

的材料用具与

相接触。

2、消毒与灭菌

（1）消毒和灭菌的区别

比较项目

条件

结果

适用

常用方法

消毒

灭菌

使用较为

的理化方法

使用

的理化因素

杀死物体

杀死

的的微生物（不包括

和

）

微生物，包括

和

二、大肠杆菌的纯化培养

（一）、固体培养基的制备：

：依据牛肉膏蛋白胨培养基

的比例，计算各成分的用量。

↓

：牛肉膏比较粘稠，可用

称取，牛肉膏和蛋白胨都容易吸潮，称取时动作要迅速，称后要及时盖上瓶盖。

↓

：

↓

：培养基

↓

：①培养基要冷却到

左右时开始到平板（

）

②要使锥形瓶的瓶口通过

③到平板时，要用左手的拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，不要完全打开，

污染培养基。

④平板冷却后要将其

。目的是

⑤若培养基溅在皿盖和皿底之间的部位，则

。

⑥整个操作过程都要在

进行，避免杂菌污染。

（二）纯化大肠杆菌

1、纯化培养原理：设法在培养基上得到由

繁殖而来的肉眼可见的

，即获得较纯的菌种。

2、纯化培养的方法：

操作

通过接种环在琼脂固体培养基表面

的操将菌液进行一系列

，然作，将聚集的菌种逐步

到培养基的表面。

后将不同

的菌液分别

到琼脂固体培养基是的表面，进行培养。

①每次划线之前之后及划线结束都要

。

②灼烧接种环之后，要等其

后才能伸入菌液。③在做第二次以及其后的划线操作时，总是从上一次划线的

开始划线

④划线时最后一区域不要与

相连。

⑤划线用力要大小适当，防止

培养基

①稀释操作中的每支试管及其中9ml的水，移液管均需

，操作时，试管口和移液管应在

。

②吸管头不要接触其他物品。

③吸管要在酒精灯火焰旁使用

④涂布器用

消毒后，在火焰上引燃，酒精燃尽

后再进行涂布。

吸收量较少，较麻烦，平板不干燥效果不好

注意事项

优点

缺点

不能计数

3、培养：将接种后的培养基和一个

的培养基都放入37℃恒温箱中，培养12小时和24小时，分别记录观察。

三、课题延伸：菌种的保藏

适用对象

培养类型

温度

方法

的菌种

的菌种

菌落长成后在冰箱中保存，每3—6个月转移到新鲜培养基中

将培养基的菌液与等体积灭菌后的

混合后置于冷冻箱中

缺点

课题2

土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

一、

筛选菌株的思路及统计菌落数目的方法

（一）

筛选菌株的思路

1、

自然界中的目的菌株的筛选：

（1）依据：根据它对

的要求，到相应的环境中去寻找。

（2）实例：PCR技术过程中用到的耐高温的

，就是从热泉中筛选出来的tap细菌中提取出来的。

2、实验室中的目的菌株的筛选

（1）原理：人为提供有利于

生长条件（包括营养、温度、PH等），同时

的生长。

（2）方法：利用选择培养基分离

①选择培养基：

②实例：

加减成份

分离菌种

加青霉素等抗生素

加高浓度食盐水

不加氮源（无氮培养基）

不加碳源（无碳培养基）

以尿素为唯一氮源

以纤维素为唯一碳源

（二）

统计菌落数目

1、

常用方法：

（1）原理：

①当样品的

足表面够高时，培养基表面生长出

，来源于稀释培养液中的

。

②通过统计平板上的

来推测样品中大约有的活菌数。

（2）计算公式：

=（C÷V）×M C：代表某一稀释度下平板上生长的

M：代表涂布平板时所用的

（ml），

M代表

（3）注意事项：

①为了保证结果的准确，每个稀释度，一般设置

，选择菌落在30—300的平板进行计数，并取

②统计的菌落数往往要比活菌的实际数目

，原因是当两个或多个细胞连在一起，平板上观察到的只是

，因此，统计结果一般用

，而不用

③设置对照：主要目的是排除实验组中

对实验结果的干扰，提高实验结果的可信度。

2、其他方法：

直接计数

3、两种常用的计数方法比较

主要用具

计数依据

优点

缺点

计算公式

显微镜、

菌株本身

计数方便、操作简单

死菌活菌都计算在内

间接计数

培养基

培养基上

计数都是活菌

操作复杂，有一定误差

二、

实验设计及操作提示

（一）实验设计

1、土壤取样：（1）土壤要求：富含

，PH接近中性且潮湿（2）取样要求：距离地面

的土壤层。

2、制备培养基：准备

，

制备9个平板培养基。

3、样品稀释：（1）稀释原因：样品稀释程度直接影响平板上生长的菌落数目。（2）稀释标准：选用一定稀释范围的样品液进行培养，保证获得的菌落数在

，便于计数。（3）稀释倍数：测定土壤中

的

的数量，一般选用

；测定

的数量，一般选用

；测定真菌的数量，一般选用

。

4、涂布平板：（1）在上述培养基中的9个平板地面，每三个一组分别记号104、105和106倍三种稀释液。

（2）

用三支1ml无菌吸管分别从104、105和106倍的三管土壤稀释液中吸取0.1ml 对号放入已写好稀释度的平板，用无菌涂布器在培养基表面上轻轻涂布均匀。

5、培养观察：（1）培养：不同种类微生物，需要不同的培养

和培养

。

（2）观察：每隔24小时统计一次菌落数目，最后选取

时的记录为结果。

6、计数：当菌落数目稳定时，取同一稀释度下的3个平板计数，求出

并根据对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。

（二）操作提示

1、无菌操作

（1）去土壤的用具在使用前需要

（2）应在

，并在火焰附近将称好的土样倒入锥形瓶，塞好

（3）在稀释土壤样液的过程中，每一步都在

操作

2、做好标记：

本实验使用的平板和试管比较多，为避免混淆，最好使用前就做好

（1）培养皿的标记：注明培养基的种类、培养日期以及平板上培养样品的

等

（2）试管标记：将已经进行过稀释操作的试管，按

的顺序，依次放在试管架的另一行。

3、制定计划：对于耗时较长的生物实验，事先要

，以便提高工作效率。

（三）菌种鉴定

1、原理：分解尿素的细菌合成的

将尿素分解为

，使培养基的

增强。

2、方法：在以

的培养基中加入

指示剂培养细菌，若指示剂变

，初步鉴定该种细菌能够分解尿素。

三、实验结果分析与评价：

内容

判断有无杂菌污染

选择培养基的筛选作用

现象

对照的培养皿中无菌落生长

菌落形态多样，菌落数偏高

牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目

选择培养基上的菌落数目

得到3个或3个以上菌落数目在

30—300的平板

结论

培养基灭菌彻底

培养基混入其他杂菌

选择培养基具有

作用

样品的稀释操作

重复组的结果

操作成功

若选取同一种土样，统计结果应

课题3

分解纤维素的微生物的分离

一、

纤维素与纤维素酶及纤维素分解菌的筛选

（一）

纤维素

1、化学组成：由

元素→

→

2、分布：纤维素是地球上含量最丰富的

类物质，

是自然界中纤维素含量最高的天然产物，此外，木材、作物等也富含纤维素。

3、种类：天然维生素、商品维生素（水溶性的

，水不溶性的

）

（二）纤维素酶

1、组成：纤维素酶是一种

，包括三种成分，即

2、作用

纤维素

（

）

纤维二糖（

）葡糖糖

3实验验证：

试管

实验组

对照组

滤纸条

1cm

×

6cm 1cm

×

6cm 缓冲液PH=8 10ml

ml 纤维素酶

ml

﹨

条件

试管置于锥形瓶中并在摇床上震荡反应1h 结果

完全分解

基本无变化

（二）

纤维素分解菌的筛选：

1、

原理：

纤维素酶

刚果红+

培养基中会出现以

为中心的

2、方法：

染色法

二、实验设计

（一）实验设计流程

1、土壤取样：选择富含

的环境

↓

2、选择培养：(1)

目的：

，确保能够从样品中分离所需的

（2）操作方法：将土样加入装有30ml

的锥形瓶中，将锥形瓶固定在

上，一定温度下震荡培养1—2d ,直至培养液变

，也可重复选择培养。

↓

2、

梯度稀释

↓

4、涂布培养：将样品涂布到

的培养基上

↓

5、筛选菌株：

染色法，挑选产生

的菌落

比较项目

区别

优点

缺点

方法一

，进行颜色反应

方法二

操作简单，不存在菌落混杂

显示出的颜色基本是

的作用

操作

，加入刚果红会使

①培养基中含有淀粉的等物质，够

发生混杂

产生

的微生物出现假阳性反应②有些微生物长时间培养会

，从而形成明显的

三、课题延伸—纤维素分解菌的鉴定

1、为确定得到的透明圈的菌落是纤维素分解菌，需要进行发酵产

的实验，纤维素酶的发酵方法

和

两种

2、纤维素酶的测定方法，一般是采用对纤维素酶分解滤纸等纤维素后产生的

进行

测定。

纤维素分解菌筛选过程中两种培养基的比较

物理性质

目的用途

能生长的微生物

选择培养基

鉴别培养基

课题一

微生物的实验室培养

答案：

一、培养基及无菌技术

（一）培养基

1、营养物质

生长繁殖

2、液体

固体

人工合成

天然

选择

鉴别

3、水、碳源（提供碳元素的物质）、氮源（提供氮元素的物质）和无机盐，此外还需要满足微生物对PH，特殊营养物质（如维生素、氨基酸和碱基等）以及对氧气的要求。

4、固体

菌落

（二）无菌操作

1、防止外来杂菌的入侵

（1）空间

衣着和手

消毒

（2）灭菌

（3）酒精灯火焰

（4）已经灭菌处理

周围物品

2、温和

强烈

表面或内部的部分

芽孢和孢子

物质内外所有

芽孢和孢子

食品、人双手、水源等

培养基、实验培养所用金属用具等

煮沸消毒、巴氏消毒、化学药剂消毒

灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌

二、大肠杆菌的纯化培养

（一）、固体培养基的制备：

计算

配方

称量

称量纸

熔化

加热后称量纸去除，加琼脂后用玻璃棒不断搅拌，防止琼脂糊底

灭菌

高压蒸汽灭菌

倒平板

①50℃ 低于44℃会凝固，温度太高会烫手 ②

酒精灯火焰 ③瓶口的微生物 ④倒置

让水分挥发，防止水珠落入培养基

⑤不能用来培养微生物

⑥

酒精灯火焰旁

（二）纯化大肠杆菌

1、一个细胞

菌落

2、平板划线法

稀释涂布平板法

连续划线

稀释分散

梯度稀释

稀释度

涂布

①灼烧接种环

①灭菌

酒精灯火焰旁

②冷却

④70%酒精

冷却

③末端

④第一区

⑤划破

可以观察菌落特征，对混合菌进行分离

可以计数，可以观察菌落特征

3、未接种

三、课题延伸：菌种的保藏

临时保藏法

甘油保藏法

频繁使用

长期保存

固体斜面培养基

液体培养基

4℃ -20℃ 甘油 菌种易被污染或产生变异

课题2

土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

一、

筛选菌株的思路及统计菌落数目的方法

（一）1、（1）生存环境

（2）

Taq DNA聚合酶

2、（1）目的菌株

抑制或阻止其他微生物

（2）①允许特定的微生物生长，同时阻止或抑制其他种类微生物生长的培养基

②真菌

金黄色葡萄球菌

固氮微生物

尿素分解菌

纤维素分解菌

（二）1、稀释涂布平板法

（1）①稀释度

一个菌落

一个活菌

②菌落数

（2）每克样品中的菌落数

平均菌落数

稀释液的体积

稀释倍数

（3）三个平板

平均值

低

一个菌落数

菌落数

活菌数

非测试因素

2、显微镜（血球计数板）直接计数

3、直接计数

稀释涂布平板法

血球计数板

菌落数

公式略

二、（一）1、有机质

2、选择培养基

以尿素为唯一氮源

3、30-300

细菌

104、105和106倍的稀释液

放线菌

103、104和105倍的稀释液

102、103和104倍三种稀释液

5、温度

时间

数目稳定

6、平均值

（二）1、灭菌

酒精灯火焰旁称取土壤

棉塞

酒精灯火焰旁

2、标记

稀释度

稀释度递增

3、制定计划

（三）大于

筛选

30-300

相近

课题3

分解纤维素的微生物的分离

一、

纤维素与纤维素酶及纤维素分解菌的筛选

（三）

纤维素

1、C、H、O

葡萄糖

纤维素

2、多糖

棉花

（二）1、复合酶

C1酶

、

Cx酶和葡萄糖苷酶

2、C1酶

、

Cx酶

葡萄糖苷酶

3、1ml

11ml （三）1、纤维素

红色复合物

纤维素分解菌

透明圈

2、刚果红

二、实验设计

（一）1、纤维素

2、增加纤维素分解菌的浓度

选择培养基

浑浊

4、鉴别纤维素分解菌

5、刚果红

透明圈

先培养微生物，再加入刚果红

淀粉酶

假阳性

降解色素

透明圈

三、1、纤维素酶

液体发酵和固体发酵

2、葡萄糖

纤维素分解菌筛选过程中两种培养基的比较

物理性质

目的用途

能生长的微生物

选择培养基

鉴别培养基

液体

固体

能使营养成分充分消耗，以增在培养基上形成肉眼可见的加纤维素分解菌的浓度

菌落

以纤维素作为碳源和能源的大部分微生物都可以正常生微生物才可以生长

长