课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数教学实录

课题2《土壤中分解尿素的细菌的分离与计数》教学设计

一、课题目标

（一）知识与技能

1.掌握利用选择培养基分离细菌的原理和方法；

2.学会运用稀释涂布平板法（活菌计数法）测定土壤中分解尿素的细菌的数量；

（二）过程与方法

分析研究思路的形成过程，找出共性和差异性

（三）情感、态度与价值观

形成无菌无处不在的概念，养成讲究卫生的习惯

二、教材内容分析：

教材从尿素在农业上的重要用途切入，介绍了土壤中能分解尿素的细菌，进而说明这种细菌的作用是能够合成分解尿素的酶。教学中，教师可以联系生产生活实际，使学生对尿素以及分解尿素的细菌形成一定的感性认识。教材还简要地介绍了尿素的发现过程以及尿素合成的历史，这些都是“科学、技术、社会”教育的丰富素材。最后，教材明确指出了本课题的目的，有助于学生准确把握课题的方向。

三、教学重难点

教学重点：对土样的选取和选择培养基的配制

教学难点：对分解尿素的细菌的计数

四、学情分析

由于学生学习了必修教材，生物学习的科学探索的方法和能力有了一定的基础，但对于微生物本身了解的太少，更谈不上如何对微生物的分离和计数的方法了，所以通过本节课学习，学生除了能掌握细菌的分离和计数的方法，还能提高理论联系实际及科学探索等方面的能力，还可以培养他们的科学素养、耐性、协作精神。

五、教学方法：学生自主学习和讨论与教师引导、讲解及多媒体辅助教学相结合

六、课时安排：2课时

七

、教学流程：

教学

流程

环节一：从教材课题背景导入，展示课题目标。

教师活动

学生活动

阅读、倾设计意图

情景导

课程导入

背景材料：

1.尿素的利用:尿素[CO(NH2)2]——重要的农业氮肥。只能被土壤中细菌分解为NH3才能被植物吸收利用。

2.细菌利用尿素的原因：土壤中的含脲酶的细菌能够分解尿素。

课题目的：

1.从土壤中分离出能够分解尿素的细菌

2.统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌

听。

入本节目标。

环节二：

一、研究思路

（一）筛选菌株

讲授新课

1.自然界中目的菌株的筛选：

（1）实例

以PCR技术为例，引导学生探究问题的解决方法。

PCR技术：一种在体外将少量DNA大量复制的技术。此项技术要求使用耐高温的DNA聚合酶。PCR技术过程中用到的耐高温的Taq DNA聚合酶，就是从热泉中筛选出来的Taq细菌中提取出来的。

提出的问题—如何寻找耐高温的DNA聚合酶？ 解决问题的思路—寻找耐高温环境。

原因：高温条件淘汰了绝大多数微生物，而使耐高温的Taq细菌脱颖而出。

（2）获得启示（依据）：寻找目的菌种时，要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。

2.实验室中目的菌株的筛选

阅读、思考、回答。

通过实例分析让学生理解目的菌株筛选的依据和原理

引导学生根据上面实例归纳实验室微生物的筛选原理，教师再补充讲解目的

菌株筛选的方法。

（1）原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。

（2)方法：利用选择培养基分离。

a.可利用该分离对象对某一营养物质有“嗜好”的原理，专门在培养基中加入该营养物质，并且使该物质成为培养基中某类基本营养物质的唯一供给者。如筛选能分解尿素的细菌，就令尿素作为培养基中的唯一氮源。

b.可利用该分离对象对某种抑菌物质的抗性，在混合培养物中加入该抑菌物质，经培养后，其他微生物生长受抑制，而分离对象却可乘机大大增值，在数量上占优势 3.选择培养基 让学生分析本课题使用的培养基成分，回答问题。

分析、回答、倾听。

KH2PO4 1.4g NaHPO4 2.1g MgSO4 .7H2O 0.2g 葡萄糖 10.0g 尿素 1.0g 琼脂 15.0g 将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1000mL。

问题1：该培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是什么物质？

碳源：葡萄糖；氮源：尿素。

问题2：此配方能否筛选出产生脲酶的细菌？为什么？

能。只有产生脲酶的细菌才能利用尿素作为氮源而生存，而缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，会因缺乏氮源而无法生长繁殖，所以，用该培养基能够筛选出能分解尿素的微生物。

学生共同讨论、归纳选择培养基的概念、制备原理等知识。

（1）概念：允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称做选择培养基。

（2）选择培养基的制备原理：根据不同微生物的特殊营养要求或其对某一化学、物理因素的抗性不同而制备培养基。

（3）选择培养基的制备方法：在培养基中加入某种允许特定种类微生物生长，抑制或阻止其他种类微生物生长的化学成分。

（4）选择培养基的用途：使混合菌株中的目的菌变成优势菌，提高该菌的筛选率。

（5）举例说明选择培养基作用

加入青霉素的培养基：细菌不生长，酵母菌、霉菌等真菌能生长。

不加含碳有机物的无碳培养基：分离自养型微生物。

无氮源培养基：可以分离固氮微生物。

石油是唯一碳源的培养基：可以分离能消除石油污染的微生物。

将培养基放在高温环境中培养：分离耐高温的微生物。

加入高浓度的食盐：可得到金黄色葡萄球菌。

（二）统计菌落数目

１.间接计数（稀释涂布平板法或活菌计数法）

引导学生回忆稀释涂布平板法相关知识，讲解稀释涂布平板法计数的原理，以例题讲解计数方法和设置重复组的重要性。

（1）原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源

讨论、分析、回答。

回忆、回

了解选择培养基相关知识。

于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。

(2)操作

①设置重复组，增强实验的说服力与准确性。将待测样品经一系列10倍稀释，选择三个稀释度的菌液，分别取0.1 mL接种到已制备好的平板上，然后用无菌涂布器将菌液涂布于整个平板表面，放在适宜的温度下培养，计算菌落数。为使结果接近真实值，可将同一稀释度的样液加到三个或三个以上的平板上，经涂布、培养，计算出菌落平均数。

②为了保证结果准确，一般选择菌落数为30～300个的平板进行计数，若设置的重复组中结果相差太远，意味着操作有误，需重新实验。

③计算公式：每克样品中含菌数＝(C÷V)×M。

C：代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数。

V：代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)。

M：代表稀释倍数。

(3)统计方法：统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好统计多个平板，然后求取平均值。

(4)主要用具：培养基、涂布器

(5)计数依据：培养基上的菌落

(6)优点：计数的是活菌

(7)缺点：操作较复杂，有一定误差，统计的菌落数往往比活菌的实际数低。

6【例1】某同学在稀释倍数为10的培养基上测得平板上的菌落数的平均值为234，那么每毫升样品中菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1 mL）（ ）

A.2.34×10

B.2.34×10【答案】B 计算公式：每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mＬ)，M代表稀释倍数。

【例2】两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为10的培养基中，得到以下两种统计结果。

1、甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230。

2、乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板，统计的菌落数分别为689 答、归纳。

利用公式进行

用涂布平板计数法对分解尿素细菌计数。

C.234

D.23.4 计算。

回21、212、256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。

分析、 你认为这两位同学的作法正确吗？如果有问题，错在哪？ 甲：没有重复实验（至少涂布3个平板）。 乙：A组结果误差过大，不应用于计算平均值。 答。

备注：用稀释涂布平板法计数微生物时注意事项

①稀释涂布平板操作要求：按照平行重复的原则每一稀释度的菌液涂布3个

或3个以上的平板。

②计数的时机：当各平板上菌落数目稳定时进行计数。

③间接技术法统计的菌落数往往比实际数目低，原因有：

★当两个或多个细菌连在一起繁殖时，平板上观察到的只是一个菌落。

★统计结果只是活细菌产生的菌落数，而不包括死细菌的数目。

④为使结果接近真实值，一般选择菌落数在30~300的平板进行计数，要设置重复组，取其平均值。

2.

显微镜直接计数法

引导学生回忆血细胞计数板计数相关知识，讲解显微镜直接计数的原理、做法、优缺点。

(1)原理：此法利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量。

(2)方法：用血细胞计数板计数。血细胞计数板是一块特制的载玻片，上面有两个特定的面积1 mm和高0.1 mm的计数室，所以每个计数室的容积为0.1mm。在1 mm的面积里又被划分成25个(或16个)中格，每个中格进一步划分成16个(或25个)小格，计数室由400个小格组成。如图所示：

322

回忆、倾听、思考、回答。

补充血细胞计数板的图示和显微镜直接计数的操作步骤，有助于学生温故知新。

(3)主要用具：显微镜、血细胞计数板

(4)优点：计数方便、操作简单

(5)缺点：死菌、活菌都计算在内，统计的细菌数往往比实际值偏大。

中方格中的细胞总数(5)计算公式：每毫升培养液中细胞个数＝()×400×中方格中小方格个数

410×稀释倍数。

(6)显微镜直接计数的操作步骤：

①用擦镜纸擦净血细胞计数板，在计数室上面加盖盖玻片。

②摇匀菌液，用滴管吸取菌液在盖玻片边缘滴一小滴，使菌液自行渗入计数室。

③用显微镜观察并将计数室移至视野中央。

④计数：计数5个中格(规格：25×16)的总菌数(若是规格为16×25，则计数4个中格)。按照计算公式求得每毫升菌液中的含菌数。(备注：对于压边的细胞，只计数相邻的两边及其夹角上的细胞即可)

㈢设置对照

1.目的

讲解设置对照的主要目的：排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。

2.实例分析

让学生分析教材实例，设置对照。

实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数目的实验时，A同学从对应的10倍稀释的培养基中筛选出大约150个菌落，但是其他同学在同样的稀释度下只选择出大约50个菌落。其他同学认为A同学结果有问题，可能是A同学培养基被杂菌污染，或者培养基混入其他含氮物质，导致其他杂菌生长。

但A同学认为自己选用土壤样品不同导致结果不同，但是A同学没有设计对照，拿不出让同学信服的证据。你能通过设置对照，帮助A同学排除上述两个可能影响因素吗？

方案1：其他同学用与A同学一样的土样进行实验。如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。

方案2：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。

二、实验设计

先请学生阅读课本中的资料一、二、三，然后在教师的引导下指出土壤中分解尿素的细菌的分离与记数步骤：1.土壤取样；2.制备培养基； 3.样品稀释、取样涂布；4.微生物的培养、观察并记录结果；5.细菌的计数。 逐步讲解各个步骤方法和注意事项。

1.土壤取样

（１）土壤取样原因：土壤有“微生物的天然培养基”之称。同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，种类最多。

（２）要求：富含有机质(富含有机质的土壤层中微生物数量大、种类多)，酸碱度接近中性且潮湿(土壤中的微生物大约有70%~80%是细菌，此环境适宜细菌的生长)的土壤。

（３）取样部位：先铲去表层土3cm左右，再取距地表3~8cm的土壤层，将样品装入事先准备好的信封中。(取样用的小铁铲和盛土样的信封都要经过灭菌)

2.制备培养基 6

阅读、讨论、分析、回答。

阅读、演练、分析、回答。

让学生学会分析和设计对照实验。

进行实验设计，熟悉实验步骤及操作要点。

牛肉膏蛋白胨培养基作为对照组，以尿素为唯一氮源的培养基作为实验组，

用来判断选择培养基是否具有选择的作用。

37选用稀释倍数为10~10的稀释液。每个稀释度下需要3个选择培养基（平行重复原则），1个牛肉膏蛋白胨培养基，共需要制备5个牛肉膏蛋白胨培

养基和15个选择培养基；还要有两个空白对照，即不涂布稀释后菌液的选

择培养基和牛肉膏蛋白胨培养基，以验证培养基中是否含有杂菌；准备好无菌试管和移液管。 3.

样品稀释、涂布平板

（１）取样稀释：在火焰旁称取土壤10g，放入盛有90mL无菌水的三角瓶1中，振荡使土样与水充分混合。将细菌分散，制成10倍土样稀释液。用1支1mL无菌吸管从中吸取1mL土壤悬液注入盛有9mL无菌水的试管中，吹吸2345三次，充分混匀，制成10倍土壤稀释液。依次类推，制成10、10、10、6710、10倍土壤稀释液。(稀释原因：样品的稀释程度直接影响平板上生长的菌落数目) 73（２）取样涂布：按照由10～10稀释度的顺序分别吸取0.1mL进行平板涂布操作。按照浓度由低到高从10~10稀释度的顺序涂布平板，不必更换移液管(涂布时稀释倍数的选择：选用一定稀释范围的样品液进行培养，保证获得菌落数在30~300之间，便于计数。）因为土壤中各类微生物的数量是不同的，为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。

如测定土壤中细菌的数量时，一般选用10、10、10倍的稀释液进行平板涂布培养；测定土壤中放线菌的数量时，一般选用10、10、10倍的稀释液进行平板涂布培养；测定土壤中真菌的数量时，一般选用10、10、10倍的稀释液进行平板涂布培养)。将课本中“样品的稀释和稀释液的取样培养流程示意图”稍作改进，如下图：

23434545673

将课本中的流程图稍作改进，更直观，利于学生理解。

备注：

★图中1、2、3平板是选择培养基，4平板为牛肉膏蛋白胨培养基，以判断选择培养基是否具有筛选作用；要有两个空白对照，即不涂布稀释后菌液的选择培养基和牛肉膏蛋白胨培养基，以验证培养基中是否含有杂菌。

★由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此选择了一个较为宽泛的范围103～107倍的稀释液。

★实验时要对所用的平板、试管作好标记。如培养皿要注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。

4.微生物的培养、观察并记录结果

（１）培养：将涂布好的培养皿放在适宜温度(细菌一般在30～37℃的温度下培养1～2d，放线菌一般在25～28℃的温度下培养5～7 d，霉菌一般在25～28℃的温度下培养3～4d)下倒置培养。随着培养时间的延长，会有不同的菌落产生。比较牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基中菌落的数量、形态等，并做好记录。

（２）观察：微生物的菌落特征包括菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等方面（观察课本P24图2-8 菌落的特征示意图）。仔细观察分离到的菌落、最好以表格的形式将不同菌落的特征记录下来。

一般来说，在一定的培养条件下(相同的培养基、温度及培养时间)，同种微生物表现出稳定的菌落特征，如菌落形状、大小、隆起程度和颜色。

5.细菌的计数 当菌落数目稳定时，选取菌落数在30～300的平板进行计数。在同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。 思考1：能在选择培养基上生长的肯定是所筛选的目的菌吗？

原则上选择培养基只能允许特定种类的微生物生长，但实际上，微生物的培养是一个非常复杂的问题，有些微生物可以利用其他微生物的代谢产物生长繁殖，因此能在培养基上生长的微生物不一定都是所需要的微生物，还需进一步验证。

思考2：为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？

提示：这是因为土壤中各类微生物的数量(单位:株/kg)是不同的，因此，为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离, 思考3：为什么要选取菌落数目稳定时的记录作为结果？

提示：防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。

三、操作提示

指导学生阅读教材操作提示部分，明确目的。

(一)无菌操作

1.取土用的小铁铲的盛土样的信封在使用前都需要灭菌。

2.应在火焰旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入锥形瓶中，塞好棉塞。

3.在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。 (二）做好标记

注明培养基种类、培养日期、平板培养样品的稀释度等。

（三）规划时间 提高效率，在操作时更加有条不紊。

四、结果分析与评价

以下面问题为例，让学生进行结果分析与评价。

思考、讨论、回答。

阅读、归纳。

设置问题，加深对实验步骤的理解。

让学生明确实验操作中应注意的事项。

１.培养物中是否有杂菌污染：

（1）对照组培养基上无菌落生长⇒未被杂菌污染

（2）实验组培养基上菌落形态多样，菌落数偏高⇒培养基上可能混入其他氮源

２.选择培养基是否有筛选作用：

牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目明显多于选择培养基上的菌落数目⇒选择培养基具有筛选作用，已筛选出一些菌落。

３.样品的稀释操作是否成功：

如果得到了2个或2个以上菌落数在30~300的平板⇒操作成功，并能够进行菌落的计数。

4.重复组的结果是否一致：

如果选取的是同一种土样，统计结果应该相近。如果结果相差太远，需要分析产生差异原因。

五、课题延伸

讲解：本课题对能分解尿素的细菌进行初步筛选。对分离的菌种进一步鉴定，需要借助生物化学方法。

分解尿素的细菌的进一步鉴定

分析、评价。

阅读、分

进行结果分析和评价。

掌握分解尿素的细菌的鉴定方法。

活菌计数技术的拓展应用

析。

(1)鉴定原理：细菌合成的脲酶将尿素分解成氨，氨会使培养基碱性增强，PH升高。因此可以通过检测培养基PH的变化来判断该化学反应是否发生。

即：CO(NH2)2+H2O――→ CO2＋2NH3

(2)鉴定方法：以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌，若指示剂变红，则PH升高，说明该种细菌能分解尿素。

六、相关链接

脲酶

分活菌计数技术广泛应用于土壤含菌量的测定、食品卫生和水源污染度的阅读、检验等方面。如果你感兴趣，可以从下列项目中选做一个。

（一）水中细菌总数的检测：

析。

细菌的数目还可以通过滤膜法测定（以测定饮用水中大肠杆菌的数目为

例）（参阅课本P26旁栏信息和P84附录3）。

（二）空气中微生物总数的检测：可以通过下面例题的分析，学习检测的方

法。

【典型例题】 （2016课标1卷.39） [生物——选修1：生物技术实践]（15分）

空气中的微生物在重力等作用下，可以一定程度地沉降。某研究小组欲用平

板收集教室空气中的微生物，以了解教室内不同高度空气中微生物的分布情

况。实验步骤如下：

①配置培养基（成分：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、X、H2O）;

②制作无菌平板； ③设置空白对照组和若干实验组，进行相关操作； ④将各组平板置于37℃恒温箱中培养一段时间，统计各组平板上菌落的平均数。

回答下列问题: （1）该培养基中微生物所需的氮来源于_________________。若要完成步骤②，该培养基中的成分X通常是_________________。

（2）步骤③中，实验组的操作是_________________。

（3）若在某次调查中，某一实验组平板上菌落平均数为36个/平板，而空白对照组的一个平板上出现了6个菌落，这种结果说明在此次调查中出现了_________________现象。若将30（即36-6）个/平板作为本组菌落数的平均值，该做法_______________（填“正确”或“不正确”）。

【答案】（1）牛肉膏、蛋白胨 琼脂（2）将各实验组平板分别放置在教室不同高度的位置上，开盖暴露一段时间（3）污染 不正确

环节三：共同回顾本节要点：

课堂小结

一、分离筛选微生物的原理：

人为条件：有利于目的菌株生长，抑制或阻止其他微生物生长

二、分离分解尿素的细菌的选择培养基的成分：尿素作为唯一的氮源

。

三、统计菌落数目的方法 1.间接计数法（稀释涂布平板计数法）

（1）计算公式

：每克样品中的菌株数＝(C÷V)×M （2）操作：设置重复组，选择菌落数30～300的平板进行计数。

（3）设置对照 ①证明培养基未被污染，用空白培养基作对照。 ②证明选择培养基的选择作用：用牛肉膏蛋白胨培养基接种等量同种菌液作对照。

2.显微镜直接计数法 四．实验设计——结果分析与评价

五、分解尿素的细菌的鉴定方法：

在培养基中加入酚红指示剂，若指示剂变红，pH升高，说明细菌能分解尿素

。

分析、回答。

呼应、回答。

突出本节重点。