课题2　月季的花药培养ppt课件教学实录

八、花药花粉培养

单倍体，指的是具有配子体染色体组成的孢子体。

单倍体在遗传研究和植物育种中的意义在于：>

八、花药花粉培养

1、在单倍体细胞中只有1个染色体组，一旦发生突变，无论是显性还是隐性，在当代就可表现出来。因此，单倍体是体细胞遗传研究和突变育种的理想材料。

2、在品种间杂交育种程序中，通过

F1代花药培养得到的单倍体植株，经染色体加倍后，可立即成为纯合二倍体。从杂交到获得不分离的杂种后代单株只需两个世代，与常规育种方法相比，显著缩短了育种年限。

八、花药花粉培养

（一）通过花药培养产生单倍体的潜在可能性

（二）花药培养的一般程序

（三）影响雄核发育的因子

> （一）通过花药培养产生单倍体的潜在可能性

在正常发育过程中，花药→花粉囊→花粉粒→雄配子体。

在离体培养过程中，花粉粒→单倍体的孢子体。>

（二）花药培养的一般程序

1、取材

2、预处理

3、表面灭菌

4、接种

5、培养方式和培养条件

6、花粉植株的诱导

7、壮苗和移栽

8、单倍体植株的二倍化

（二）花药培养的一般程序

1、取材

花药在接种以前，应预先用醋酸洋红压片法进行镜检，以确定花粉的发育时期，并找出花粉发育时期与花蕾或幼穗的大小、颜色等外部特征之间的对应关系。

一般而言，单核后期花药对培养反应较好。

> （二）花药培养的一般程序

2、预处理

适当的预处理可以显著提高花药的愈伤组织诱导率。

常用的预处理方法是低温冷藏，具体的处理温度和时间长度因物种而异：

烟草7~9℃，7~14 d；大麦3~7℃，7~14 d。

> （二）花药培养的一般程序

3、表面灭菌

花药适于培养时，花蕾尚未开放，花药在花被或颖片的严密包被之中，本身处于无菌状态。

因此，有时只要以70%酒精喷洒（或擦拭）花器（或包被着麦穗的叶鞘）的表面，即可达到灭菌要求。

> （二）花药培养的一般程序

4、接种

在无菌条件下，将雄蕊上的花药轻轻地从花丝上摘下，水平地放在培养基上进行培养。

在整个操作过程中，务必注意避免使花药受到损伤。

若受损伤，则应淘汰，因为损伤常常会刺激花药壁形成二倍体愈伤组织。>

（二）花药培养的一般程序

如果是花器很小的植物，可能需要借助解剖镜夹取花药；或者只将花被去掉，将花蕾的其余部

分连同其中原封未动的雄蕊一起接种在培养基上。

在有些情况下，甚至是接种整个花序，以得到花粉单倍体。

由于花药对离体培养的反应存在“密度效应”，因此每个容器中接种的花药数量不宜太少，以形成一个合理的群体密度。

（二）花药培养的一般程序

5、培养方式和培养条件

花药的培养方式主要有3种：

1）在琼脂固化培养基表面培养；

2）在加入30%Ficoll （水溶性聚蔗糖）的培养基表面漂浮培养；

3）利用固体-液体双层培养基培养。

花药培养对温度、光照的要求因物种而不同。

（二）花药培养的一般程序

6、花粉植株的诱导

一般经由胚状体产生的花粉植株，几乎都是单倍体；

而经由愈伤组织产生的花粉植株，其染色体数常有变化（其中既有单倍体，也有二倍体、三倍体及各种非整倍体等）。

> （二）花药培养的一般程序

在不能经由胚状体途径的植物中，花粉植株的诱导往往要分两步进行：

第一步，将花药接种在含有2，4-D（1~2 mg/L）的诱导培养基上，诱导花粉粒形成单倍体愈伤组织；

第二步，当花粉愈伤组织形成后10~15 d，直径已长到1.5~2.0 mm时，及时将其转到分化培养基上诱导植株分化。在分化培养基中不加2，4-D，但一般含有NAA和KT等。

（二）花药培养的一般程序

7、壮苗和移栽

> （二）花药培养的一般程序

8、单倍体植株的二倍化

诱导染色体加倍的化学方法：用秋水仙素或氨磺灵等试剂处理。

可采用活体诱导（浸苗；借助羊毛脂涂于上部芽）或离体诱导（浸泡外植体；加入培养基）。

为了增强处理效果，在秋水仙素、氨磺灵等的溶液中，可加入1%~2%的助渗剂——二甲基亚砜（DMSO）。

> （三）影响雄核发育的因子

雄核发育（androgenesis）是指小孢子沿孢子体途径发育成花粉植株的过程。

影响雄核发育的因子很多，除上节提到的以外，还包括以下5个方面：

> （三）影响雄核发育的因子

1、基因型

2、生理状态

3、花粉发育时期

4、“药壁因子”

> （三）影响雄核发育的因子

5、培养基

（1）基本培养基

（2）碳源

（3）植物生长物质

（4）活性炭

> （三）影响雄核发育的因子

1、基因型——重要因子。

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（三）影响雄核发育的因子

2、生理状态——供体植株的年龄、所处的生长条件。

供体植株的年龄及其所处的生长条件也能影响花药对离体培养的反应。一般来说，幼年植株的花药对离体培养的反应能力较好。在开花末季采集的花药不但形成孢子体的频率很低，而且发生反应的时间也较迟。

由供体植株生长条件的差异造成的花药对培养反应的不同，可能是内生激素水平变动的结果。

（三）影响雄核发育的因子

3、花粉发育时期

在诱导花粉进行雄核发育的过程中，花粉在接种时所处的发育时期，可能比培养基成分更为重要。

一般而言，单核后期花药对培养反应较好，但不同物种最适的发育时期不同。

> （三）影响雄核发育的因子

4、“药壁因子”

大量证据表明，在花粉胚发育过程中，花药壁起着重要的作用。

花药对于同一物种以及不同物种离体花粉雄核发育具有看护作用；甚至花药浸提液也能刺激花粉胚的形成。由绒毡层起源的某些重要物质的梯度变化，对于诱导花粉粒发育成胚起着关键的作用。用谷氨酰胺、丝氨酸、肌醇等，可取代“药壁因子”在花粉胚发育中的作用。

（三）影响雄核发育的因子

5、培养基

（1）基本培养基

基本培养基对花药培养的成败影响很大。常用培养基MS、Nitsch等对花药培养普遍适用。此外，又根据花药培养的特殊要求，设计了几种新配方，如N6、C17、W14等。

与MS培养基相比，新配方培养基的一个共同特点是，大幅度降低了其中氨离子浓度，并调整了其中铵态氮和硝态氮的比例。

（三）影响雄核发育的因子

（2）碳源

在花药培养中，蔗糖一直是最常用的碳源。

但近年来，有些研究者使用其它糖类，如麦芽糖、果糖和葡萄糖等作碳源，取得了更好的培养效果。

除了作碳源之外，蔗糖在培养基中还起着调节渗透压的重要作用。

在花药培养中，蔗糖的常用浓度为3%~15%。

> （三）影响雄核发育的因子

（3）植物生长物质

培养基中的生长物质对于诱导花粉细胞的增殖和发育起着重要作用。

取决于植物种类的不同，花药在离体培养中对生长物质的要求有2种不同的情况：

1）雄核发育途径是：直接形成花粉胚的植物。在这些（茄科）植物中，一般不需要添加生长物质。在基本培养基上就可以产生完整单倍体植株；在有些情况下，甚至于维生素也无必要。

（三）影响雄核发育的因子

2）在大多数已知能进行雄核发育的非茄科物种中，花粉粒首先形成愈伤组织；然后，或是在同一培养基中，或是在略加改变的培养基中，由愈伤组织分化出孢子体。

在这些植物中，为了诱导花药进行雄核发育，必须单独地，或以不同配比在培养基中，加入生长物质、复杂的营养混合物（如酵母浸出液等）和椰子汁等。> （三）影响雄核发育的因子

（4）活性炭

有些研究结果表明，活性炭对雄核发育具有促进作用；

但是另些报告指出，在花粉愈伤组织诱导培养基中，添加活性炭可能是有害而无益的。>