课题3　血红蛋白的提取和分离教学设计及教案分析

5.3血红蛋白的提取和分离 教案

1．了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。(重点) 2．体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程与方法。(难点)

一．基础知识：

蛋白质的提取和分离依据：根据蛋白质各种______的差异，如分子的______和大小、所带______的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离____________的蛋白质。

（一）凝胶色谱法（分配色谱法）：

1.概念：根据__________________________________________分离蛋白质的有效方法。

2.凝胶：是一些微小的_____球体，由___类化合物（如葡聚糖、琼脂糖等）构成。

3.原理：相对分子质量较大的，在凝胶_____，路程_____，流动_____；

相对分子质量较小的，在凝胶_____，路程_____，流动_____。

4.

具体过程:图5-13. 例1：用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中，关于蛋白质的叙述，正确的是（

）

A.相对分子质量较小的蛋白质行程大于相对分子质量较大的蛋白质

B.相对分子质量较小的蛋白质行程小于相对分子质量较大的蛋白质

C.相对分子质量较小的蛋白质行程等于相对分子质量较大的蛋白质

D.二者根本无法比较

例2：相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中的进行过程可表示为图中哪一个（

）

（二）缓冲溶液(洗脱剂): 1.定义：在一定的范围内，凡是能够抵制外加少量强酸或强碱的影响，使原溶液PH值__________________的混合溶液。

2.作用：抵制外界酸碱对溶液pH的干扰而保持 pH____________。

3.组成：由______和相应的强碱弱酸盐盐溶解于水中。

思考：说出人体血液中缓冲对？_________________________________ 4.本实验加的是什么缓冲液？为何要加缓冲液？______________________________

例3：缓冲液能在一定范围内维持（ ）

A.

温度基本不变；B.PH基本不变；C.渗透压基本不变；D.凝胶颗粒结构稳定。 （三）电泳：

1.

概念：带电粒子在_______作用下发生________的过程。

2.

原理：

(1)带电粒子：许多重要的生物________，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团会带上________或________。

(2)移动方向：在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷_____的电极移动。

(3)分离依据：电泳利用了待分离样品中各种分子________的差异以及分子本身的________，形状的不同使带电分子产生不同的________，从而实现样品中各种分子的分离。

3.常用的电泳方法:________________和________________ 聚丙烯酰胺凝胶电泳：

(1)

聚丙稀酰胺凝胶：是由单体丙烯酰胺和交联N,N-甲叉双丙烯酰胺在_________和_________的作用下聚合交联成_________结构的凝胶。

(2)

原理：蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带_________的多少以及_______等因素。

为了消除静电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加入_________。

（3）SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳作用机理: SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是__________________。

SDS能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于__________________。

例4：使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于

A 电荷的多少 B 分子的大小 C 肽链的多少 D 分子形状的差异

二.实验操作(血红蛋白的提取和分离): 思考：（材料的选取）用哪类动物的红细胞提取血红蛋白？原因？

________________________________________________________________________

回顾：血液有哪些成分？

____________________________________

探讨1：蛋白质的提取和分离一般分为_______步：

处理步骤

样品处理

主要操作

（ ）的洗涤

（ ）的释放

（ ）血红蛋白溶液

粗分离

纯化

纯度鉴定

电泳

(一)样品处理及粗分离：

1.洗涤红细胞：

阅读思考：(1)洗涤的目的是什么？______________________________

(2)洗涤的方法是什么？______________________________

(3)洗涤干净的标志是什么？______________________________ 目的

探讨2：

1.

在采血容器中为何要预先加入柠檬酸钠？_____________________ 2.离心时为何低速、短时离心？_________________________________________

3.为何要缓慢搅拌？____________________________________________________

4.洗涤次数过少会出现怎样的结果？______________________________ 用什么办法将红细胞中的血红蛋白释放出来？

2.血红蛋白的释放：

阅读思考：释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入了哪些物质，有什么用？

目的分析：(1)蒸馏水的作用是______________________________。

(2)加入甲苯的作用是____________________________。

(3)充分搅拌的目的是____________________________。

红细胞破碎后，得到的混合物不仅含有血红蛋白，还含有细胞破碎物、脂质、甲苯有机溶剂，怎样去除这些杂质呢？

3.分离血红蛋白溶液:方法：________________________

例5.在采血容器中加入柠檬酸钠的目的是( ) A 调节pH B 维持红细胞的能量供应C 防止微生物生长 D 防止血液凝固

例6:下列是有关血红蛋白提取和分离的相关操作，其中正确的是（ ）

A．可采集猪血作为实验材料 B．用蒸馏水重复洗涤红细胞

C．血红蛋白释放后应低速短时间离心 D．洗脱液接近色谱柱底端时开始收集流出液

如何去除血红蛋白溶液中无机盐离子和小分子有机物质呢？

4.透析：

思考：透析的原理是什么？目的是什么？

____________________________、____________________________ 探讨3：在透析过程中，血红蛋白溶液中的小分子、离子不断通过半透膜扩散到PH=7的磷酸溶液中。为何使用PH=7的磷酸溶液？为何缓冲液量要多于血红蛋白溶液量？

____________________________、____________________________ 通过以上4个基本过程，红细胞中血红蛋白被提取出来了。但其中还含有其他种类蛋白质（例呼吸酶等）。怎样将杂蛋白和血红蛋白分离开来呢？

（二）凝胶色谱法－纯化：

1.凝胶色谱柱的制作：

①取_____________，两端磨平; ②底塞的制作：打孔→挖出凹穴→安_____________→覆盖尼龙网，再用尼龙纱包好，插到玻璃管的一端。

③顶塞的制作：打孔→安装玻璃管。④组装：将上述三者组装成一个整体。

2.凝胶色谱柱的装填：

材料：交联葡聚糖凝胶G-75；20mmol/L_________缓冲液

探讨4：装填步骤







步骤

固定色谱柱

操作要求

色谱柱垂直固定在支架上

立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡12h ④

⑤

洗涤平衡

探讨5：1.凝胶装填时为何装填紧密，均匀？______________________

2.为何装填凝胶柱时不得有气泡存在？_________________________________

3.样品的加入和洗脱：

调整缓冲液面：与_________平齐

↓

滴加透析样品：用量为1 mL

↓

样品渗入凝胶床：样品完全_________凝胶层

↓

洗脱：打开下端出口，用__________________洗脱

↓

收集：待红色的蛋白质接近色谱柱_________时，用试管收集流出液，每5 mL 收集一管，连续收集

探讨6：1.在血红蛋白纯化的整个过程中不断用磷酸缓冲液处理的目的是什么？________________________________________________

2.与其他蛋白质相比，血红蛋白有什么特点？这一特点对你进行血红蛋白的分离有什么启示？____________________________________________________________

例7：在装填凝胶柱时，不能有气泡存在的原因是（ ）

A.气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果

B.气泡阻碍蛋白质的运动 C.气泡与蛋白质发生化学反应

D.气泡在装填凝胶的时候，使凝胶不紧密

例8.样品的加入和洗脱的操作不正确的是（ ）

A.加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到凝胶面的下面 B.加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内

C.等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口

D.用吸管小心的将1ml透析后的样品加到色谱柱的顶端，不要破坏凝胶面

（三）SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳

1.目的：________________________________________________