课题2　多聚酶链式反应扩增DNA片段优秀完整教案

教学目标：

（一）知识与技能

1、了解PCR技术的基本操作

2、理解PCR的原理

3、讨论PCR的应用

（二）过程与方法

在多聚酶链式反应扩增DNA片段的实验过程中，应避免外源DNA污染，严格控制温度等反应条件

（三）情感、态度与价值观

通过对PCR实验的操作及结果分析，培养学生严谨的科学态度和实事求是的科研精神

教学重点：PCR的原理和PCR的基本操作

教学难点：PCR的原理

教学过程：

（一）引入新课

在现代生物技术中，DNA技术可谓是尖端技术。人类基因组计划、基因工程、基因诊断、基因检测、古生物鉴定等都离不开对DNA分子碱基序列的分析。而分析DNA碱基序列，就需要一定量的DNA片段。怎样迅速获得足够量的DNA片段呢？今天我们来研究学习DNA分子的扩增技术――PCR技术。

一、PCR扩增的原理和过程（阅读教材P58～62）

1．细胞内DNA复制的条件

原料

模板

酶

引物

4种脱氧核苷酸

2条DNA母链

解旋酶和DNA聚合酶

使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸

2.PCR扩增的原理及条件

1

(1)PCR(多聚酶链式反应)：一种体外迅速扩增

DNA片段的技术。它能以极少量的

DNA为模板，在短时间内复制出上百万份的DNA拷贝。

(2)原理：DNA的热变性原理，即：

(3)扩增方向：总是从子链的

5′端向

3′端延伸。

(4)条件

①模板：DNA。

②引物：能分别与

DNA两条模板链相结合的物质。

③原料：4种脱氧核苷酸。

④酶：耐高温的DNA聚合酶，一般用Taq DNA聚合酶。

⑤其他条件：需要稳定的缓冲溶液和能自动调控温度的温控设备。

(5)引物

一小段

DNA或

RNA，能与DNA母链的一段碱基序列互补配对，用于PCR引物的长度通常为20～30个核苷酸。

3．PCR的反应过程

(1)变性：温度上升到

90 ℃以上时，双链DNA解聚为单链。

(2)复性：温度下降到50 ℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。

(3)延伸：温度上升到72 ℃左右时，溶液中的四种脱氧核苷酸(A、T、C、G)在

DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新DNA链。

二、实验操作及DNA含量的测定

（阅读教材P62～63）

1．实验操作程序

准备―→移液―→混合―→离心―→反应。

2．DNA含量的测定

(1)原理：利用DNA在

260_nm的紫外线波段的吸收峰曲线来测定相应含量。

(2)计算公式：DNA含量(μg/mL)＝50×(260 nm处紫外分光光度计的读数)×稀释倍数。

注：在标准厚度为1 cm的比色杯中，OD260为1相当于50 μg/mL的双链DNA。

2

[共研探究] 多聚酶链式反应简称PCR，是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，这项技术中DNA复制的过程和细胞内DNA复制的过程是类似的。请结合已学过的DNA分子结构和复制的相关知识，回答下列问题。

1．PCR技术

(1) PCR的原理：在

80～100_℃的温度范围内，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性。当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链。

(2)子链扩增：需要引物，合成方向总是从子链的

5′

端向

3′

端延伸。

(3)条件

①模板：DNA。

②引物：分别与DNA两条模板链相结合的两种小的核酸片段。

③原料：A、T、G、C四种脱氧核苷酸。

④酶：耐热DNA聚合酶，一般用耐高温的Taq_DNA聚合酶。

⑤其他条件：需要一定的缓冲溶液和能严格控制温度的温控设备。

(4)PCR扩增中的重点解读

①DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从引物的3′端延伸DNA链，因此扩增DNA时应加入两种引物。

②PCR扩增DNA过程中不需要解旋酶。

③利用PCR技术扩增1个DNA分子n次，所得DNA分子中，不含引物的脱氧核苷酸链所占的比例是1/2n。含引物的DNA分子所占的比例是100%。

2．PCR技术的过程

(1)变性：当温度上升到90 ℃以上时，双链DNA解聚为单链。

(2)复性

温度下降到50 ℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。

(3)延伸

温度上升到72 ℃左右，溶液中的四种脱氧核苷酸(A，T，C，G)在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。

3．PCR扩增的理论计算

PCR扩增时，DNA数目呈指数形式扩增。若只有一条DNA模板，则复制n次后有2n条DNA；若一开始有a条模板，则复制n次后有a×2n条DNA。

[总结升华] 生物体内的DNA复制与PCR反应的比较

3

时期

场所

酶

解旋

引物

体内DNA复制

细胞有丝分裂间期和减数第一次分裂前的间期

活细胞内

解旋酶、DNA聚合酶

在解旋酶的作用下，细胞提供能量，部分解开

一小段RNA PCR反应

体外随时进行

微量离心管内

耐高温的DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶) 加热至90 ℃以上时，双链全部解开，不需解旋酶

可以是RNA也可以是单链DNA分子片段

分别从两条链的引物的3′端开始，都是连续合成，控制温度在72 ℃左右

体外迅速扩增

30多次

DNA片段

不

同

点

合成

在引物基础上，一条链连续合成，另子链

一条链不连续合成

特点

循环

次数

产物

原料

相

同

点

复制

原理

模板

引物

边解旋边复制，半保留复制

受生物体自身控制

完整DNA 4种脱氧核苷酸(A、G、C、T) 严格遵循碱基互补配对原则，半保留复制

以DNA母链为模板

都需要分别与两条模板链相结合的两种引物

【易错易混】

关于PCR技术的4个易误点

(1)DNA母链的3′端对应着子链的5′端，即DNA的两条链是反向平行的。

(2)解旋酶的作用是使DNA两条链的氢键断开，DNA聚合酶、DNA连接酶催化形成磷酸二酯键。

(3)DNA聚合酶是将单个核苷酸加到已有的单链片段的3′端上，需要模板；而DNA连接酶连接的是两条DNA片段的缺口，不需要模板。

(4)从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合，进行DNA的延伸。这样，DNA聚合酶只能特异地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数形式扩增。

[对点演练] 1．近20年来，PCR技术(多聚酶链式反应)成为分子生物学实验室的一种常规实验手段，其原理是利用DNA半保留复制，在试管中进行DNA的人工复制(如图)，在短时间内，将DNA扩增几百万倍甚至几十亿倍，从而使实验室所需要的遗传物质不再受限于活的生物体。

(1)加热使DNA双链间的__________键完全打开，称为________；而在细胞中是在________酶的作用下进行的。

(2)如果只需要大量克隆模板DNA中间的某个特定区段，应该加入________种特定的引物。当温度降低至55 ℃时，引物与两条“舒展”的模板的特定位置结合，在DNA聚合酶的作用下，只能在引物的________端连接脱氧核苷酸，两条子链的延伸方向都是

4

________________。

(3)PCR技术的必需条件，除了模板、原料、酶之外，至少还有三个条件，即液体环境、适宜的________和________，前者由________自动调控，后者则靠________来维持。

(4)通过PCR技术使DNA分子大量复制，如果将一个用15N标记的DNA分子放入试管中，以14N 标记的脱氧核苷酸为原料，连续复制四次之后，则15N 标记的DNA分子占全部DNA分子总数的比例是________。

解析：(1)PCR技术利用热变性原理使DNA双链之间的氢键断裂，称为解旋，而在细胞内是在解旋酶的作用下使氢键断裂。(2)PCR分为三个基本反应步骤：变性(95 ℃)、复性(55 ℃)、延伸(72 ℃)，其特异性依赖于与靶序列互补的引物，引物是两段与待扩增DNA序列互补的片段，两引物之间的距离决定扩增片段的长度。由于DNA聚合酶只能从引物的3′端延伸DNA链，则DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸。(3)PCR技术与细胞内的DNA复制不完全相同，除了需要模板、原料、酶以外，还需要液体环境(稳定的缓冲溶液)，每一个步骤都需要适宜的温度和酸碱度等。(4)一个DNA分子连续复制四次之后，形成16个DNA分子，15N标记的DNA分子有2个，则15N标记的DNA分子占全部DNA分子总数的比例为1/8。

答案：(1)氢

解旋

解旋

(2)两

3′

从子链的5′端向3′端延伸

(3)温度

酸碱度

PCR仪

缓冲液

(4)1/8 [共研探究]

PCR是在PCR仪中完成的，经过多次的循环使DNA片段得以大量地扩增，这个过程有严格的操作规程。

1．结合下面实验操作过程，回答下列问题：

(1)实验操作过程

准备：按照PCR反应体系的配方将所需试剂摆放于实验桌上

↓

移液：用微量移液器按照配方向微量离心管中依次加入各组成成分

↓

混合：盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管的侧壁

↓

离心：将微量离心管放在离心机上，离心约10 s，使反应液集中在离心管底部

↓

反应：将离心管放入PCR仪中进行反应

(2)注意事项

①避免外源DNA污染：所用离心管、缓冲液、蒸馏水等使用前必须进行高压灭菌。

②缓冲液和酶分装成小份，并在－20_℃储存。

③每添加一种反应成分，更换一个移液器上的枪头。

④混匀后离心处理，使反应液集中在离心管底部。

2．实验中DNA含量的测定

5

理论上DNA呈指数增长，但实际可能会有诸多因素影响DNA含量，所以需要对DNA含量进行测定。

(1)原理：DNA在260 nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰。峰值的大小与DNA的含量有关，可以利用DNA的这一特点进行DNA含量的测定。

(2)过程

①稀释：取2 μL PCR反应液，加入98 μL蒸馏水，即将样品进行50倍稀释。

②对照调零：以蒸馏水作为空白对照，在波长260 nm 处，将紫外分光光度计的读数调节至零。

③测定：取DNA稀释液100 μL至比色杯中，测定260 nm 处的光吸收值。

④计算：DNA含量(μg/mL)＝50×(260 nm的读数)×稀释倍数。

[总结升华] 1．PCR过程用到的重要仪器

(1)PCR仪：该仪器能自动调控温度，实现DNA的扩增。如果没有PCR仪，可用3个恒温水浴锅代替，操作时按程序在3个水浴锅中来回转移PCR反应的微量离心管。

(2)微量离心管：总容积为0.5 mL，实际上是进行PCR反应的场所。

(3)微量移液器：用于向微量离心管中转移PCR配方中的液体。

2．PCR技术的应用

(1)医学上用该技术分析人的精液，对细菌、病毒感染进行早期诊断。

(2)对单细胞中的DNA进行扩增，用于遗传病的基因诊断，并在此基础上进一步制备无突变的DNA片段供遗传病患者基因治疗时使用。

(3)法医学用此技术来鉴别罪犯或进行亲子鉴定。

(4)古生物学用此技术分析古生物化石样品，追溯其生存年代或迁徙踪迹。

(5)在农业生物技术中，可运用此技术检测目的基因是否已经成功导入目标生物等。

[对点演练] 2．下列对PCR的实验操作顺序的叙述，正确的是(

) A．准备→移液→混合→离心→反应

B．准备→移液→离心→混合→反应

C．离心→移液→混合→反应

D．移液→离心→混合→反应

解析：选A

PCR的实验操作中，首先是准备，即按照PCR反应体系的配方将需要的试剂摆放在实验桌上；其次是移液，即用微量移液器按照配方在微量离心管中依次加入各组分；然后是混合，即盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁，使反应液混合均匀；接着是离心，即将微量离心管放在离心机上，离心约10 s；最后是反应。

1．PCR技术扩增DNA，需要的条件是(

) ①目的基因

②引物

③四种脱氧核苷酸

④耐热的DNA聚合酶

⑤mRNA

⑥核糖体

A．①②③④

B．②③④⑤

C．①③④⑤

D．①②③⑥

6

解析：选A

PCR技术扩增DNA需要DNA模板(目的基因)、两种引物、四种脱氧核苷酸和耐热的DNA聚合酶等。

2．下列有关PCR技术的叙述，不正确的是(

) A．PCR技术利用的是碱基互补配对原则

B．PCR技术可用于基因诊断，判断亲缘关系等

C．PCR技术需在体内进行

D．PCR技术可分为变性、复性、延伸三个阶段

解析：选C

PCR技术是聚合酶链式反应的简称，是在体外快速大量复制DNA片段的一种新技术。

3．DNA的复制需要引物，主要原因是(

) A．可加快DNA的复制速度

B．引物可与DNA母链通过碱基互补配对结合

C．引物的5′端有助于DNA聚合酶延伸DNA链

D．DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链

解析：选D

DNA聚合酶不能从5′端开始合成DNA，而只能从3′端延伸DNA链，因此，DNA复制需要引物。当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的3′端开始延伸DNA链，DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸。

4．PCR技术有效地解决了因为样品中DNA含量太低而难以对样品进行研究的问题，而被广泛应用，与细胞内的DNA复制相比，PCR可以快速扩增所需的DNA片段，请分析回答下列有关问题：

(1)体内DNA复制过程中用解旋酶打开双链DNA，而PCR技术中的解旋原理是________________________________。

(2)此过程需要一种Taq DNA聚合酶，该酶是从__________________中分离的。

(3)与普通DNA聚合酶相比，Taq DNA聚合酶具有的特性是____________。

(4)与体内DNA复制相比较，PCR反应要在________________中才能进行，并且要严格控制________条件。

(5)PCR中加入的引物有________种，加入引物的作用是_____________________。

解析：(1)PCR技术中用高温使DNA分子中的氢键打开，从而解旋，其原理是DNA的热变性原理。(2)Taq

DNA聚合酶是从水生耐热细菌Taq中提取的。(3)与普通DNA聚合酶相比，Taq DNA聚合酶在90 ℃以上的环境中不变性，具有耐高温的特性。(4)PCR反应需要适宜的温度和pH，因此PCR反应要在一定的缓冲溶液中进行，并需要严格控制好温度条件。(5)PCR需要两种引物，引物的识别位点决定了PCR扩增的DNA片段。PCR中加入的引物是小段单链DNA或RNA，作用是引导DNA复制，可以使游离的脱氧核苷酸与之结合形成磷酸二酯键，成为DNA复制的起点。

答案：(1)DNA的热变性原理

(2)水生耐热细菌Taq

(3)耐高温

(4)一定的缓冲溶液

温度

(5)2

作为DNA复制的起点

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