课题2　多聚酶链式反应扩增DNA片段优秀教学设计内容

专题5 DNA与蛋白质技术

课题5.2 多聚酶链式反应扩增DNA片段

黑龙江省浩良河化肥厂学校 徐龙涛

【三维目标】

知识与技能

1.

理解PCR的原理和反应过程。

2.

讨论PCR的应用

过程与方法

在多聚酶链式反应扩增DNA片段的实验过程中，应避免外源DNA污染，严格控制温度等反应条件。

情感态度价值观

通过对PCR实验的操作及结果分析，培养学生严谨的科学态度和实事求是的科研精神。

【教学重点】

PCR的原理和PCR的基本操作

【教学难点】

PCR的原理

【教学方法】

启发式教学、讨论式、自主学习等

【教学工具】

多媒体课件

【教学过程】

一、引入

情境创设：利用教材课题背景引入新课

人类基因组计划、刑侦破案、基因诊断、基因检测、古生物鉴定等都离不开对DNA分子碱基序列的分析。而分析DNA碱基序列，就需要一定量的DNA片段。怎样迅速获得足够量的DNA片段呢？在本课题的学习中我们来研究学习DNA分子的体外扩增技术――PCR技术。

二、新课

1、通过课堂提问环节检查导学案预习内容掌握完成情况。

2、简要回顾DNA分子能准确复制的原因是什么？

DNA双螺旋结构提供模板；碱基互补配对；

3、结合DNA细胞内复制条件、过程，探究DNA体外应具备复制条件、过程。

①细胞内DNA复制条件分析：

条件

模板

原料

酶

能量

组分

DNA的两条单链

四种脱氧核苷酸

解旋酶

DNA聚合酶

ATP 作用

提供复制的模板

合成DNA子链的原料

打开DNA双螺旋

催化合成DNA子链

为解螺旋和合成子链供能

1

引物

RNA 为DNA聚合酶提供合成的3’端起点

②细胞内DNA复制过程

（1）DNA的反向平行结构：（结合教材图5－6）

核苷酸分子的结构与方向性：（分子结构模式图）

由核苷酸通过3,5-磷酸二酯键连接形成核苷酸长链：（模式图，体现方向性）。

DNA双螺旋结构的反向平行结构：

（2）DNA的复制过程: 解旋：解旋酶、ATP，DNA两条链打开，，形成两条DNA单链。

引物结合：在DNA单链3’端与DNA反向配对结合，确保引物3’端与DNA单链准确配对。

DNA聚合酶结合：

子链合成：DNA聚合酶从引物3’端开始，将配对的脱氧核苷酸连接起来。

后续加工：DNA聚合酶I将引物切去，并合成空缺处的DNA单链，再由DNA连接酶将不连续的DNA子链连接起来（半不连续合成。先导链，滞后链）

子链合成特点：不能从头合成；合成方向为“5’→3’合成”。

感悟生命的神秘：DNA聚合酶不但能够催化磷酸二酯键的形成，还具有校对功能。它在每引入一个核苷酸后都要复查一次，只有碱基配对无误后才能继续往下聚合，它不能从头合成。RNA聚合酶没有校对功能，因此RNA的合成不需要引物，而是从头合成的，它的错配可能性较大，在RNA引物完成功能后即被DNA聚合酶I删去，代之以高保真的DNA链。

③DNA分子复制的人工复制过程

解开螺旋：在80～100℃时，DNA双螺旋打开，形成两条DNA单链，称为变性。

恢复螺旋：在50℃左右时，两条DNA单链重新形成双螺旋结构，称为复性。

复制条件：缓冲液,DNA模板,四种脱氧核苷酸,热稳定DNA聚合酶,两种引物。

反应场所：PCR仪（自动温度周期性调节）。

［思考］缓冲液相当细胞内的什么成分？（核基质）

④PCR的反应基本过程

变性：在95℃时DNA解旋

复性：在50℃时引物与DNA单链结合

延伸：在72℃时合成DNA子链（两个引物间的序列）

4．实验操作

① PCR反应体系：缓冲液、DNA模板，四种脱氧核苷酸原料、热稳定DNA聚合酶、两种RNA引物，水

②实验操作步骤

③按照PCR反应体系配方配制反应液；

（1）将PCR反应体系50μL用微量移液器转移到微量离心管（0.5mL）中；

（2）将微量离心管放到PCR仪中；

（3）设置PCR仪的工作参数。

2 变性

复性

延伸

（4）DNA在PCR仪中大量扩增。

5．实验注意事项

①避免外源DNA污染：所用仪器、缓冲液、蒸馏水等使用前高压灭菌。

②缓冲液和酶分装成小份，－20℃低温保存。

③在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头必须更换。

④混匀后离心处理，使反应液集中在离心管底部。

⑤PCR实验中应注意各种反应成分的用量，用量不当、漏加成分、PCR程序设置不当等，均有可能导致DNA片段扩增的失败。

⑥PCR扩增的是位于两种引物之间的DNA片段，合理设计引物是PCR成功的关键。

特别提示：⑴PCR扩增过程中要进行无菌操作，避免污染。

⑵在操作中离心约10s，目的是使反应液集中在离心管底部，提高反应效果。

4．结果分析与评价

①反应液稀释：取2µLPCR反应液，添加98µL蒸馏水；2．分光光度计调零：将100µL蒸馏水添加到比色杯中，在260nm处将分光光度计调整读数为零。

②将100µL反应稀释液倒入比色杯中，测定在260nm处的光吸收值。

③计算：DNA含量＝50×光吸收值×稀释倍数

三、课堂总结

四、巩固练习（见课件）

五、板书设计（略）

多聚酶链式反应扩增DNAPCR原理

DNA的复制需要酶、原料、能量、引物

DNA的变性和复性受温度影响

变性

复性

延伸

移入离心管

放入PCR 计算

PCR过程

操作步骤

配制PCR反应体系

设置工作参数

调零

DNA扩增

测定含量

稀释

片段测定并读数

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