课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数公开课教案

专题2-2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数教学设计

【教学目标】

（一）知识与技能

利用选择培养基分离细菌，运用相关技术解决生产生活中有关微生物的计数

（二）过程与方法

分析研究思路的形成过程，找出共性和差异性

（三）情感、态度与价值观

形成无菌不在的概念，养成讲究卫生的习惯

【教学重点】

对土样的选取和选择培养基的配制

【教学难点】

对分解尿素的细菌的计数

【教学准备】

课件、教学设计

【教学过程】

（一）引入新课

上节课我们学习了培养基的配置以及接种技术。下面我们来学习如何进行细菌的分离，获得所需要的目的微生物。

（二）进行新课

基础知识——尿素及其利用

尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农作物吸收。尿素只有被土壤中的细菌分解成氨（和CO2）之后才能被植物利用。土壤中的细菌能分解尿素是因为它们能合成脲酶。

课题目的: ①从土壤中分离出能够分解尿素的细菌

②统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌

一、研究思路：

㈠.筛选菌株

㈡.统计菌落数目

㈢.设置对照

㈠.筛选菌株

科学家能从热泉中把耐热细菌筛选出来是因为热泉的高温条件淘汰了绝大多数微生物

，这样也适用于实验室中微生物的筛选，原理是人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、PH等），同时抑制或阻止其他微生物生长

。

生物适应一定环境，环境对生物具有选择作用。所以通过配制选择培养基、控制培养条件等选择目的微生物。

实例：DNA多聚酶链式反应（PCR）是一种在体外将少量DNA大量复制的技术，此项技术要求使用耐高温（930C）的DNA聚合酶。

1966年布鲁克从热泉中发现耐热细菌Taq，并从中分离出耐高温的Taq DNA聚合酶。

启示：寻找目的菌种时，要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。

实验室中微生物（目的菌株）的筛选: 人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。

配置合适的培养基方法：

⑴抑制大多数微生物生长；

⑵造成有利于该菌生长的环境。

结果：培养一定时间后，该菌数量上升，再通过稀释涂布平板法等方法对它进行纯化培养。

选择培养基：在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。

土壤中分解尿素的细菌所需培养基:（展示配方）

提问：①在此培养基中哪些作为碳源、氮源？

碳源：葡萄糖

氮源：尿素

②从物理性质看此培养基属于哪类？从用途上属于哪类培养基？

固体培养基；选择培养基

㈡.统计菌落数目：

提问：在统计菌落数目时，常用方法是？

显微镜直接计数法和稀释涂布平板法（或称活菌计数法）。

常用来统计样品中活菌数目的方法是稀释涂布平板法

。

除此之外，

显微镜直接计数也是测定微生物数量的常用方法。

【补充】显微镜直接计数是测定微生物的方法。

公式：观察到的红细胞平均数∶观察到的细菌平均数＝红细胞含量∶细菌含量

采用稀释涂布平板法统计菌落数目时，培养基表面生长的一个菌落，来源于

样品稀释液中一个活菌

。通过统计

平板上的菌落数

，就能推测出样品中大约含有多少活菌。为了保证结果准确，一般选择菌落数在

30～300 的平板进行计数。

提问：从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数的计算方法是？

（平均菌落数÷涂布的稀释液体积）×稀释倍数

。

提问：利用稀释涂布平板法成功统计菌落数目的关键是？

恰当的稀释度。

例：通常用血球计数板对培养液中酵母菌进行计数，若计数室为1mm×1mm×0.1mm大方格，由400个小方格组成。若多次重复计数后，算得每个小方格中平均有5个酵母菌，则10mL该培养液中酵母菌总数有多少个？2×108

统计的菌落数比活菌的实际数目低，为什么？

这是因为当两个或多个细胞在一起时，平板上观察到的只是

一个

菌落。因此，统计结果一般用菌落数来表示。

注意事项：

①为了保证结果准确，一般选择菌落数在30—300个的平板上进行计数。

②为使结果接近真实值，一般将同一稀释度菌液至少设置三个平板实验，经涂布、培养，计算出菌落平均数。

③统计的菌落往往比活菌的实际数目少。因此，统计结果一般用菌落数而不是用活菌数。

实例1：两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。

1、甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230。

2、乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。

你认为这两位同学的作法正确吗？如果有问题，错在哪？

甲：第一位同学只涂布了一个平板，没有设置重复组，（至少涂布3个平板），因此结果不

具有说服力。

乙：第二位同学考虑到设置重复组的问题，涂布了3个平板，但是，其中1个平板的计数结果与另2个相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误，因此，不能简单地将3个平板的计数值用来求平均值。

实例2：在做本课题的实验时，A同学从对应106倍稀释的培养基中筛选出大约150个菌落。但是，其它同学在同样的稀释度下只选择出大约50个菌落。

其他同学认为A同学的结果有问题。他们分析可能是A同学的培养基被杂菌污染了，或者培养基中混入了其他含氮物质，因而导致不能分解尿素的细菌也能在该培养基上生长。

但是，A同学确信自己的实验操作准确无误，与其他同学的结果之所以不相同，是因为自己所选用的土壤样品不同。但是，A同学在设计实验的时候并没有设置对照，因而此时也拿不出令同学们信服的证据。

你能通过设置对照，帮助A同学排除上述两个可能影响实验结果的因素吗？

㈢.设置对照：

设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。

设置对照的方法：

空白对照：不给对照组任何处理因素。

自身对照：对照组和实验组都在同一研究对象上进行。

相互对照：不单设对照组，而是几个实验组相互对照。

A同学的结果与其他同学不同，可能的原因有两种。

一是由于土样不同；二是由于培养基污染或操作失误。

方案一：由其他同学用与A同学相同土样进行实验

结果预测：如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。

方案二：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。

小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。

二、实验设计：对能分解尿素的细菌进行分离和计数

实验设计的内容包括实验方案、材料用具、实施步骤和时间安排等。

根据图示2－7填写以下实验流程：

1.土壤取样

2.制备培养基

3.样品稀释、涂布平板接种

4.培养观察、记录

5.计数

1.土壤取样

土壤微生物主要分布在距地表3～8cm的近中性土壤中，约70％～80％为细菌。

2.制备培养基

①培养基配制的基本过程是？

②如何判断配制的选择培养基是否起到选择作用？

制备两种培养基：

尿素为唯一氮源培养基（选择培养基）

牛肉膏蛋白胨培养基（完全培养基）

将菌液稀释相同的倍数，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，因此，牛肉膏蛋白胨培养基可以作为对照，用来判断选择培养基是否起到了选择作用。

制备5个牛肉膏蛋白胨培养基和15个选择培养基，准备好无菌试管和移液管。

注：选用稀释倍数为103-107的稀释液。每个稀释度下需要3个选择培养基（平行重复原则），1个牛肉膏蛋白胨培养基。

3.样品稀释、涂布平板接种

在火焰旁称取土壤10g，倒入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，塞好棉塞。依次等比稀释至106稀释度

注意：稀释过程中，每一步都要在火焰旁进行。

样品的稀释程度直接影响平板上生长的菌落数目，因此要选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得的菌落数在

30～300

之间，便于计数。

分离不同的微生物采用不同的稀释度，其原因

不同微生物在土壤中含量不同

。

细菌稀释度一般为

104、105、106

，

放线菌稀释度为

103

、

104、105

，

真菌稀释度为

102、103、104

。

4.培养观察、记录

将涂布好的培养皿放在30℃下培养。比较牛肉膏培养基和选择培养基中菌落的数量、形态等，并做好记录。

注：培养不同微生物往往需要不同的培养温度和培养时间；

细菌：30～37℃，培养1～2d 放线菌：25～28℃，培养5～7d 霉菌：25～28℃，培养3～4d 一般来说，在一定的培养条件下(相同的培养基、温度及培养时间)，同种微生物表现出稳定的菌落特征。

5.计数

在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。

选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。

当菌落数目稳定时，选取菌落数在

30～300 的平板进行计数。在同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数，然后求出

平均值

，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中的细菌数目。

三、操作提示

1、无菌操作

2、做好标记

3、制定计划

[一]无菌操作

1、取土样的用具在使用前都需要

灭菌

。

2、应在

火焰

旁称取土壤。在火焰附近将土样倒入锥形瓶中，塞好棉塞。

3、在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。

[二]做好标记

本实验使用的平板和试管比较多，为避免混淆，最好使用前就做好标记：注明培养基种类、培养日期、平板培养样品的稀释度等。

[三]制定计划

四、课外延伸

在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌后，如果PH升高，指示

剂将变红，说明

该细菌能够分解尿素

。

说明：氨会使培养基的碱性增强，PH升高，因此，可通过检测培养基PH的变化来判断该化学反应是否发生。

（三）课堂总结、点评