课题2　多聚酶链式反应扩增DNA片段ppt配套教案和课堂实录

专题5 DNA与蛋白质技术

课题5.2 多聚酶链式反应扩增DNA片段

一、【课题目标】

（一）知识与技能

1、了解PCR技术的基本操作

2、理解PCR的原理

3、讨论PCR的应用

（二）过程与方法

在多聚酶链式反应扩增DNA片段的实验过程中，应避免外源DNA污染，严格控制温度等反应条件

（三）情感、态度与价值观

通过对PCR实验的操作及结果分析，培养学生严谨的科学态度和实事求是的科研精神

二、【课题重点】

PCR的原理和PCR的基本操作

三、【课题难点】

PCR的原理

四、【教学方法】

启发式教学

五、【教学工具】

多媒体课件

六、【教学过程】

（一）引入新课

在现代生物技术中，DNA技术可谓是尖端技术。人类基因组计划、基因工程、基因诊断、基因检测、古生物鉴定等都离不开对DNA分子碱基序列的分析。而分析DNA碱基序列，就需要一定量的DNA片段。怎样迅速获得足够量的DNA片段呢？今天我们来研究学习DNA分子的扩增技术――PCR技术。点击超链接，欣赏《PCR之歌》，引起学生兴趣。

（二）进行新课

1．基础知识

1.1 DNA分子的结构

元素组成、基本单位、多脱氧核苷酸链的形成、DNA分子的双螺旋结构

1.2DNA的复制

1.2.1概念

时期

场所

基本条件

条件

模板

原料

酶

DNA聚合酶

能量

引物

复制特点

遵循原则

精确复制的原因：DNA双螺旋结构提供模板；碱基互补配对；DNA聚合酶的复查功能。

复制的意义：DNA分子通过复制使遗传信息从亲代传给了后代，从而保持了遗传信息的连续性。

1.3 总结：胞内DNA复制的基本体系

1.4 PCR（多聚酶链式反应）

1.4.1 定义

1.4.2 DNA聚合酶特性

1.4.3 DNA聚合酶作用过程

解 旋：高温使DNA两条链打开，形成两条DNA单链。

引物结合：在DNA单链3’端与DNA反向配对结合，确保引物3’端与DNA单链准确配对。

DNA聚合酶结合：

子链合成：DNA聚合酶从引物3’端开始，将配对的脱氧核苷酸连接起来。

子链合成特点：不能从头合成；合成方向为“5’→3’合成”。

1.5 PCR原理

⑴.在80－100°C的温度范围内，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性。

ATP RNA 催化合成DNA子链

为解螺旋和合成子链供能

为DNA聚合酶提供合成的3’端起点

组分

DNA的两条单链

四种脱氧核苷酸

解旋酶

作用

提供复制的模板

合成DNA子链的原料

打开DNA双螺旋

⑵.当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链。

⑶.PCR利用了DNA的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合，现在使用的PCR仪实质上也是一台能够自动调控温度的仪器。

1.6 Taq DNA聚合酶的应用

1.7 需要为PCR反应提供的物质

缓冲液、DNA模板，四种脱氧核苷酸原料、热稳定DNA聚合酶、两种RNA引物，水

1.8 PCR技术的特点

PCR技术是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、

简便、重复性好、易自动化等突出。

1.9 细胞内和细胞外DNA复制环境的区别

1.10 细胞内复制和PCR不同点

⑴.PCR过程需要的引物不是RNA，而是人工合成的DNA单链，其长度通常为20－30个脱氧核苷酸

⑵.PCR过程中DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的

1.11 PCR的重要应用：

广泛应用于遗传病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆和DNA序列测定等。

2 PCR的实验操作

2.1 设备及用具

PCR仪、微量离心管、微量移液器

2.2 实验操作步骤

播放超链接，一个实验室配制体系的视频，使学生更直观的感受到整个流程。

准备、移液、混合、离心、反应

2.2.1 PCR一般经历三十多次循环，每次循环可以分为三个基本步骤---变性、复性和延伸。

播放超链接，一个PCR过程的动画，直观讲述PCR过程。

⑴.变性（模板DNA解旋）

模板DNA经加热至900C以上。一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使成为单链，以便于它与引物结合，为下轮反应作准备。

⑵.复性（退火）

模板DNA经加热变性成单链后，温度降到500C左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。

⑶.延伸

DNA模板－引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下以脱氧核苷酸为原料，以母链为模板，按碱基互补配对的原则与半保留复制的原理，合成一条新的DNA链。

2.2.2图片展示PCR反应过程。

2.2.3 注意事项

PCR技术高度灵敏，为了避免外源DNA等因素的污染而造成干扰实验，PCR操作时要注意做到：⑴隔离操作区，所用微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用必须进行高压灭菌；

⑵分装试剂，简化操作程序，使用一次性枪头

3 课题成果评价

3.1 理论上DNA扩增数目的计算

3.2 实验中DNA含量的测定

原理：可以通过计算DNA含量来评价扩增的效果，DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与DNA的含量有关。

过程：稀释，对照调零，计算

4 课题延伸

PCR技术是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。

它具有特异、敏感、产率高、

快速、

简便、重复性好、易自动化等突出特点

例如：PCR产物每轮循环增加一倍，30轮循环扩增量达230个拷贝（109拷贝）

5 实验小结

PCR仪加热使（

模板 ）变性, 复性使引物与模板DNA（

互补 ）,延伸需将反应温度升至中温( 72度 ),在（ Taq DNA聚合酶）的作用下,以

（四种脱氧核苷酸

）为原料,以（

引物）为复制的起点,合成新链。

如此重复改变反应温度,经（

变性、复性和延伸

）三个阶段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍; 将扩增产物进行电泳,经溴化乙锭染色,在紫外灯照射下肉眼能见到扩增特异区段的DNA带。

（三）课堂总结、点评

（四）布置作业