课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数教学设计及教案分析

第二节：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数教学设计

石家庄市第六中学

雷英军

一、教材分析

教材从尿素在农业上的重要用途切入，介绍了土壤中能分解尿素的细菌，进而说明这种细菌的作用是能够合成分解尿素的酶。教学中，教师可以联系生产生活实际，使学生对尿素以及分解尿素的细菌形成一定的感性认识。教材还简要地介绍了尿素的发现过程以及尿素合成的历史，这些都是“科学、技术、社会”教育的丰富素材。最后，教材明确指出了本课题的目的，有助于学生准确把握课题的方向。

二、教学目标

1.知识与技能

利用选择培养基分离细菌，运用相关技术解决生产生活中有关微生物的计数。

2.过程与方法

体验无菌操作的实验过程。

3.情感、态度与价值观

关注我们身边周围都存在细菌，养成讲究卫生的良好习惯。

三、教学重点

对土样的选取和选择培养基的配制。

四、教学难点

对分解尿素的细菌的计数。

五、教学过程

（一）菌种的筛选与选择培养基

1.菌种的筛选： (1)自然界中目的菌株的筛选：

①依据：根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。

②实例：PCR技术过程中用到的耐高温的Taq DNA聚合酶，就是从热泉中筛选出来的Taq细菌中提取出来的。

(2)实验室中目的菌株的筛选：

①原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。

②方法：利用选择培养基分离。

a.可利用该分离对象对某一营养物质有“嗜好”的原理，专门在培养基中加入该营养物质，并且使该物质成为培养基中某类基本营养物质的唯一供给者。如筛选能分解尿素的细菌，就令尿素作为培养基中的唯一氮源。

b.可利用该分离对象对某种抑菌物质的抗性，在混合培养物中加入该抑菌物质，经培养后，其他微生物生长受抑制，而分离对象却可乘机大大增值，在数量上占优势。 2.选择培养基：

(1)概念：指允许特定种类的微生物生长，同时阻止或抑制其他种类微生物生长的培养基。

(2)选择培养基的制备原理：根据不同微生物的特殊营养要求或其对某一化学、物理因素的抗性不同而制备培养基。

(3)选择培养基的制备方法：在培养基中加入某种允许特定种类微生物生长，抑制或阻止其他种类微生物生长的化学成分。

(4)选择培养基的用途：使混合菌株中的目的菌变成优势菌，提高该菌的筛选率。

(5)实例：在培养基中以尿素为唯一的氮源，可得到能利用尿素的微生物。(所需培养基的配方如表所示) 培养基组成

KH2PO4

Na2HPO4

MgSO4·7H2O 葡萄糖

尿素

琼脂

水

含量

1.4 g 2.1 g 0.2 g 10.0 g 1.0 g 15.0 g 容到1 000 mL 碳源

氮源、能源

凝固剂

氢元素、氧元素

无机盐

提供的营养或作用

(6)常见的选择培养基

①加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌。

②加入高浓度的食盐可得到金黄色葡萄球菌。

③无氮源培养基可以分离固氮微生物。

④石油是唯一碳源的培养基，可以分离能消除石油污染的微生物的目的。

⑤将培养基放在高温环境中培养，分离耐高温的微生物。

思考1：能在选择培养基上生长的肯定是所筛选的目的菌吗？

原则上选择培养基只能允许特定种类的微生物生长，但实际上，微生物的培养是一个非常复杂的问题，有些微生物可以利用其他微生物的代谢产物生长繁殖，因此能在培养基上生长的微生物不一定都是所需要的微生物，还需进一步验证。

（二）土壤中分解尿素的细菌的分离

1.实验流程

(1)土壤取样：

①土壤取样原因：土壤有“微生物的天然培养基”之称。同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，种类最多。

②要求：富含有机质(富含有机质的土壤层中微生物数量大、种类多)，酸碱度接近中性且潮湿(土壤中的微生物大约有70%~80%是细菌，此环境适宜细菌的生长)的土壤。

③取样部位：先铲去表层土3cm左右，再取距地表3~8cm的土壤层，将样品装入事先准备好的信封中。(取样用的小铁铲和盛土样的信封都要经过灭菌) (2)制备培养基：以牛肉膏蛋白胨培养基作为对照组，以尿素为唯一氮源的培养基作为实验组，用来判断选择培养基是否具有选择的作用。

(3)样品的稀释与涂布平板：

①取样稀释：在火焰旁称取土壤10g，放入盛有90mL无菌水的三角瓶中，振荡使土样与水充分混合。将细菌分散，制成10倍土样稀释液。用1支1mL无菌吸管从中吸取1mL土壤悬2液注入盛有9mL无菌水的试管中，吹吸三次，充分混匀，制成10倍土壤稀释液。依次类推，1

制成10、10、10、10、10倍土壤稀释液。(稀释原因：样品的稀释程度直接影响平板上生长的菌落数目) 73②取样涂布：按照由10～10稀释度的顺序分别吸取0.1mL进行平板涂布操作。按照浓度从7310~10的顺序涂布平板，不必更换移液管(涂布时稀释倍数的选择：选用一定稀释范围的样品液进行培养，保证获得菌落数在30~300之间，便于计数；如测定土壤中细菌的数量时，456一般选用10、10、10倍的稀释液进行平板涂布培养；测定土壤中放线菌的数量时，一般3452选用10、10、10倍的稀释液进行平板涂布培养；测定土壤中真菌的数量时，一般选用10、3410、10倍的稀释液进行平板涂布培养)。如下图：

34567

(4)微生物的培养与观察：

①培养：将涂布好的培养皿放在适宜温度(细菌一般在30～37℃的温度下培养1～2d，放线菌一般在25～28℃的温度下培养5～7 d，霉菌一般在25～28℃的温度下培养3～4d)下倒置培养。随着培养时间的延长，会有不同的菌落产生。比较牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基中菌落的数量、形态等，并做好记录。

②计数：当菌落数目稳定时，选取菌落数在30～300的平板进行计数。在同一稀释度下，至少对3个平板进行计数，然后求出平均值，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。

③观察：微生物的菌落特征包括菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等方面。仔细观察分离到的菌落、最好以表格的形式将不同菌落的特征记录下来。

2.结果分析

(1)是否有杂菌污染：

①对照组培养基上无菌落生长⇒未被杂菌污染

②实验组培养基上菌落数偏高⇒被杂菌污染

③实验组培养基上菌落形态多样，菌落数偏高⇒培养基上可能混入其他氮源

(2)选择培养基是否有筛选作用：

牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目明显多于选择培养基上的菌落数目⇒选择培养基具有筛选作用

(3)样品的稀释操作：

如果得到了2个或2个以上菌落数在30~300的平板⇒操作成功

(4)重复组的结果：

若选取的是同一种土样，统计结果应该接近。

3.分解尿素的细菌的进一步鉴定

(1)鉴定原理：细菌合成的脲酶将尿素分解成氨，氨会使培养基碱性增强，PH升高。因此可以通过检测培养基PH的变化来判断该化学反应是否发生。

脲酶即：CO(NH2)2+H2O――→ CO2＋2NH3

(2)鉴定方法：以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌，若指示剂变红，则PH升高，说明该种细菌能分解尿素。

（三）微生物数量的测定方法

1.稀释涂布平板法(或活菌计数法或间接计数法) (1)原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。

(2)操作

①设置重复组，增强实验的说服力与准确性。将待测样品经一系列10倍稀释，选择三个稀释度的菌液，分别取0.1 mL接种到已制备好的平板上，然后用无菌涂布器将菌液涂布于整个平板表面，放在适宜的温度下培养，计算菌落数。为使结果接近真实值，可将同一稀释度的样液加到三个或三个以上的平板上，经涂布、培养，计算出菌落平均数。

②为了保证结果准确，一般选择菌落数为30～300个的平板进行计数，若设置的重复组中结果相差太远，意味着操作有误，需重新实验。

③计算公式：每克样品中含菌数＝(C÷V)×M。

C：代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数。

V：代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)。

M：代表稀释倍数。

(3)统计方法：统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好统计多个平板，然后求取平均值。

(4)主要用具：培养基、涂布器

(5)计数依据：培养基上的菌落

(6)优点：计数的是活菌

(7)缺点：操作较复杂，有一定误差，统计的菌落数往往比活菌的实际数低。

备注：用稀释涂布平板法计数微生物时注意事项

①稀释涂布平板操作要求：按照平行重复的原则每一稀释度的菌液涂布3个或3个以上的平板。

②计数的时机：当各平板上菌落数目稳定时进行计数。

③间接技术法统计的菌落数往往比实际数目低，原因有：

★当两个或多个细菌连在一起繁殖时，平板上观察到的只是一个菌落。

★统计结果只是活细菌产生的菌落数，而不包括死细菌的数目。

④为使结果接近真实值，一般选择菌落数在30~300的平板进行计数，要设置重复组，取其平均值。

2.显微镜直接计数法

(1)原理：此法利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量。

(2)方法：用血细胞计数板计数。血细胞计数板是一块特制的载玻片，上面有一个特定的面22积1 mm和高0.1 mm的计数室，在1 mm的面积里又被划分成25个(或16个)中格，每个中格进一步划分成16个(或25个)小格，计数室由400个小格组成。如图所示：

(3)主要用具：显微镜、血细胞计数板

(4)优点：计数方便、操作简单

(5)缺点：死菌、活菌都计算在内，统计的细菌数往往比实际值偏大。

中方格中的细胞总数4(5)计算公式：每毫升培养液中细胞个数＝()×400×10×稀释倍数。

中方格中小方格个数(6)显微镜直接计数的操作步骤：

①用擦镜纸擦净血细胞计数板，在计数室上面加盖盖玻片。

②摇匀菌液，用滴管吸取菌液在盖玻片边缘滴一小滴，使菌液自行渗入计数室。

③用显微镜观察并将计数室移至视野中央。

④计数：计数5个中格(规格：25×16)的总菌数(若是规格为16×25，则计数4个中格)。按照计算公式求得每毫升菌液中的含菌数。(备注：对于压边的细胞，只计数相邻的两边及其夹角上的细胞即可) 六、板书设计

（四）课后练习

1、下列有关培养基的叙述正确的是?

A、培养基是为微生物的生长繁殖提供营养的基质

B、培养基只有两类：液体培养基和固体培养基

C、固体培养基中加入少量水即可制成液体培养基

D、微生物在固体培养基上生长时，可以形成肉眼可见的单个细菌

2、不同培养基的具体配方不同，但一般都含有?

A、碳源、磷酸盐和维生素

B、氮

源和维生素

C、水、碳源、氮源和

无机盐

D、碳元素、氧元素、氢元素、氮元素

3、制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的步骤是?

A、计算、称量、倒平板、溶化、灭菌

B、计算、称量、溶化、倒平板、灭菌

C、计算、称量、溶化、灭菌、倒平板

D、计算、称量、灭菌、溶化、倒平板

4、有关倒平板的操作错误的是?

A、将灭过菌的培养皿放在火焰旁的桌面上

B、使打开的锥形瓶瓶口迅速通过火焰

C、将培养皿打开，培养皿盖倒放在桌子上

D、等待平板冷却凝固后需要倒过来放置

5、有关平板划线操作正确的是?

A、使用

已灭菌的接种环、培养皿，操作过程中不再灭菌

B、打开含菌种的试管需通过火焰灭菌，取出菌种后需马上塞上棉塞

C、将沾有菌种的接种环迅速伸人平板内，划三至五条平行线即可

D、最后将平板倒置，放人培养箱中培养

6、关微生物营养物质的叙述中，正确的是?

A、是碳源的物质不可能同时是氮源

B、凡碳源都提供能量

C、除水以外的无机物只提供无机盐

D、无机氮源也能提供能量

答案：AACCD 六．教学反思

本节课知识点包括研究思路（筛选菌株、统计菌落数目、设置对照）、实验设计及操作提示几个要点知识。

其中，尿素分解菌的分离与计数是重点，学生掌握较好，对于

实验设计原理理解充分，但是由于不具备实验条件，无法实际操作因此感性知识比较缺乏。

本知识点主要考点集中在对尿素分解菌的鉴定方法上，其次是微生物计数的方法也是常见考点，

显微镜直接计数法虽然只是一个数据换算，但是过于繁琐，学生掌握情况不佳。可以利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量，进行练习。