课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数教学设计一等奖

选修1

生物技术实践

专题2 微生物的培养与应用

课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

一、教学目标

1.知识目标

了解有关选择培养基的基础知识。

2.能力目标

a.用涂布平板计数法进行微生物数量测定。

b.设计对照实验。

3.情感目标

形成无菌不在的概念，养成讲究卫生的习惯。

二、教学重点

对土样的选取和选择培养基的配制。

三、教学难点

对分解尿素的细菌的计数。

四、考情分析

1.考纲要求：

2.题型与分值：非选择题，满分15分

五

、教学流程

教学流程

教师活动

学生

活动

设计意图

温故而知新：课前2分钟背诵

1、培养基

据物理性质：液体培养基、固体培养基、半固体培养基

环节1 导入

据化学成分：天然培养基、合成培养基

据用途/功能：选择培养基、鉴别培养基

2、培养基的基本成分：碳源、氮源、水、无机盐

特殊营养（生长因子）：维生素、碱基、氨基酸等

3、无菌技术

关键是防止外来杂菌入侵

情景阅读、导入倾听。

本节目标。

消毒：较温和的理化方法

煮沸消毒、巴氏消毒、化学药剂消毒、紫外线消毒

灭菌：较强烈的理化方法

灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌

4、配制培养基的流程

计算→称量→溶化→调pH、分装、封口→灭菌→倒平板

5、接种

平板划线法：连续划线，每次灼烧，逐步分散

稀释涂布平板法:浸→滴→灼→涂（梯度稀释，涂布平板）

6、菌种保藏：临时保藏——接种到固体斜面培养基，4℃

长期保存——甘油管藏。1ml甘油（灭菌）＋1ml菌液；－20℃ 从教材课题背景导入，展示课题目标。

背景材料：

1.尿素的利用:尿素[CO(NH2)2]——重要的农业氮肥。只能被土壤中细菌分解为NH3才能被植物吸收利用。

2.细菌利用尿素的原因：土壤中的含脲酶的细菌能够分解尿素。

课题目标：

1.从土壤中分离出能够分解尿素的细菌

2.统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌

阅读、

（一）筛选菌株

思考、1.实例

回答。

以PCR技术为例，引导学生探究问题的解决方法。

PCR技术：一种在体外将少量DNA大量复制的技术。此项技术要

求使用耐高温的DNA聚合酶。

提出的问题—如何寻找耐高温的DNA聚合酶？

解决问题的思路—寻找耐高温环境。

环节2 原因：高温条件淘汰了绝大多数微生物。

讲授获得启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应分析、新课

的环境中去寻找。

回答。

2.实验室微生物的筛选原理

引导学生根据上面实例归纳实验室微生物的筛选原理：人为提供

有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、pH等），同时抑

制或阻止其他微生物生长。

3.选择培养基

（1）让学生分析本课题使用的培养基成分，回答问题。

KH2PO4 1.4g

NaHPO4 2.1g 一、研究思路

了解选择培养基相关知识。

MgSO4 .7H2O 0.2g 葡萄糖 10.0g 尿素 1.0g 琼脂 15.0g 将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1000mL。

问题1：该培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是什么物质？

碳源：葡萄糖、尿素；氮源：尿素。

问题2：此配方能否筛选出产生脲酶的细菌？为什么？

能。只有产生脲酶的细菌才能利用尿素作为氮源而生存。

（2）共同归纳选择培养基概念

允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称做选择培养基。

（3）举例说明选择培养基作用

加入青霉素的培养基：细菌不生长，酵母菌、霉菌等真菌能生长。

不加含碳有机物的无碳培养基：分离自养型微生物。

（二）统计菌落数目

1.显微镜直接计数

引导学生回忆血细胞计数板计数相关知识，讲解显微镜直接计数的原理、做法、优缺点。

（1）原理：利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量。

（2）做法：每一个大方格边长为 1mm ，则每一大方格的面积为1mm，盖上盖玻片后，载玻片与盖玻片之间的高度为0.1mm，所以计数室的容积为0.1mm。

（3）优缺点：

优点：能准确统计微生物的实际数目。

缺点：不能区分死菌和活菌。

2.间接计数（活菌计数法）

引导学生回忆稀释涂布平板法相关知识，讲解稀释涂布平板法计数的原理，以例题讲解计数方法和设置重复组的重要性。

（1）原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。

（2）计数：

【例1】某同学在稀释倍数为10的培养基上测得平板上的菌落数的平均值为234，那么每毫升样品中菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1 mL）（ ）

A.2.34×10

B.2.34×10【答案】B 89 632C.234

D.23.4

回忆、分析、回答。

演练、回答、归纳。

用涂布平板计数法对分解尿素细菌计数。。

计算公式：每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mＬ)，M代表稀释倍数。

【例2】两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为10的培养基中，得到以下两种统计结果。

1、甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230。

2、乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。

你认为这两位同学的作法正确吗？如果有问题，错在哪？ 甲：没有重复实验（至少涂布3个平板）。 乙：A组结果误差过大，不应用于计算平均值。 ㈢设置对照

1.目的

讲解设置对照目的：排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。

2.实例分析

让学生分析教材实例，设置对照。

实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数目的实验时，A同学从对应的10倍稀释的培养基中筛选出大约150个菌落，但是其他同学在同样的稀释度下只选择出大约50个菌落。其他同学认为A同学结果有问题，可能是A同学培养基被杂菌污染，或者培养基混入其他含氮物质，导致其他杂菌生长。

但A同学认为自己选用土壤样品不同导致结果不同，但是A同学没有设计对照，拿不出让同学信服的证据。你能通过设置对照，帮助A同学排除上述两个可能影响因素吗？

方案1：其他同学用与A同学一样的土样进行实验。如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。

方案2：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。

二、实验设计

指出土壤中分解尿素的细菌的分离与记数步骤：1.土壤取样；2.制备培养基； 3.样品稀释、取样涂布；4.微生物的培养、观察并记录结果；5.细菌的计数。 逐步讲解各个步骤方法和注意事项。

1.土壤取样

从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。 66

设计对照实验。

阅读、倾听、思考、回答。

设计对照实验。

进行实验设计。

2.制备培养基 牛肉膏蛋白胨培养基作为对照，判断选择培养基是否起到选择作用。 选用稀释倍数为10~10的稀释液。每个稀释度下需要3个选择培养基（平行重复原则），1个牛肉膏蛋白胨培养基，共需要制备5个牛肉膏蛋白胨培养基和15个选择培养基，准备好无菌试管和移液管。 3.样品稀释、取样涂布

因为土壤中各类微生物的数量是不同的，为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。 测定土壤细菌数量，一般选用10、10和10倍的稀释液进行平板培养；测定放线菌的数量，一般选用10、10和10倍稀释液；测定真菌的数量，一般选用10、10和10倍稀释液。 将10g土样加入盛有90mL无菌生理盐水的锥形瓶中,充分摇匀，吸取上清液1mL，转移至盛有9mL水的无菌试管中，依次等比稀释至10稀释度，并按照由10至10稀释度的顺序分别吸取0.1mL进行平板涂布操作。按照浓度从低到高的顺序涂布平板，不必更换移液管。 注意：由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此选择了一个较为宽泛的范围：稀释倍数为10～10。

4.微生物的培养、观察并记录结果

将涂布好的培养皿放在30℃下培养。比较牛肉膏培养基和选择培养基中菌落的数量、形态等，并做好记录。 不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。细菌一般在30~37℃的温度下培养1~2d；放线菌一般在25~28℃的温度下培养5~7d；而霉菌一般在25~28℃的温度下培养3~4d。 一般来说，在一定的培养条件下(相同的培养基、温度及培养时间)，同种微生物表现出稳定的菌落特征，如菌落形状、大小、隆起程度和颜色。

5.细菌的计数 当菌落数目稳定时，选取菌落数在30~300的平板进行计数。在同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。 三、操作提示

指导学生阅读教材操作提示部分，明确目的。

(一)无菌操作

1.取土用的小铁铲的盛土样的信封在使用前都需要灭菌。

2.应在火焰旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入锥形瓶中，塞好棉塞。

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阅读、回答。

演练、回答。

分解、评价。

进行结果分析和评价。

3.在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。 (二）做好标记

注明培养基种类、培养日期、平板培养样品的稀释度等。

（三）规划时间 提高效率，在操作时更加有条不紊。

【典型例题】 （2016课标1卷.39） [生物——选修1：生物技术实践]（15分）

空气中的微生物在重力等作用下，可以一定程度地沉降。某研究小组欲用平板收集教室空气中的微生物，以了解教室内不同高度空气中微生物的分布情况。实验步骤如下：

①配置培养基（成分：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、X、H2O）; ②制作无菌平板； ③设置空白对照组和若干实验组，进行相关操作； ④将各组平板置于37℃恒温箱中培养一段时间，统计各组平板上菌落的平均数。

回答下列问题: （1）该培养基中微生物所需的氮来源于_________________。若要完成步骤②，该培养基中的成分X通常是_________________。

（2）步骤③中，实验组的操作是_________________。

（3）若在某次调查中，某一实验组平板上菌落平均数为36个/平板，而空白对照组的一个平板上出现了6个菌落，这种结果说明在此次调查中出现了_________________现象。若将30（即36-6）个/平板作为本组菌落数的平均值，该做法_______________（填“正确”或“不正确”）。

【答案】（1）牛肉膏、蛋白胨 琼脂（2）将各实验组平板分别放置在教室不同高度的位置上，开盖暴露一段时间（3）污染 不正确

四、结果分析与评价

以三个问题为例，让学生进行结果分析与评价。

（一）培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选菌落。

对照的培养皿在培养过程中没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。牛肉膏培养基的菌落数明显大于选择培养基的数目，说明选择培养基已经筛选出一些菌落。

（二）样品的稀释操作是否成功。

如果得到了2个或2个以上菌落数目在30 ～300平板，说明稀释比较成功，并能够进行菌落的计数。

（三）重复组的结果是否一致。

如果选取的是同一种土样，统计结果应该相近。如果结果相差太

远，需要分析产生差异原因。

五、课题延伸

讲解：本课题对能分解尿素的细菌进行初步筛选。对分离的菌种进一步鉴定，需要借助生物化学方法。

在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的脲酶将尿素分解成了

氨

。氨会使培养基的碱性增强

，PH 升高

。因此，我们可以通过检测培养基pH变化来判断该化学反应是否发生。 在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变红

，说明该细菌能够分解尿素

。

共同回顾本节要点：

一、选择培养基的成分：尿素作为唯一的氮源

。

二、鉴定方法：

在培养基中加入酚红指示剂，若指示剂变红，pH升高，说明细菌能分解尿素

。

三、统计菌落数目的方法 环节3 （1）显微镜直接计数法 课堂（2）间接计数法（稀释涂布平板计数法）

小结

①计算公式

：每克样品中的菌株数＝(C÷V)×M ②操作：设置重复组，选择菌落数30～300的平板进行计数。

（3）设置对照 ①证明培养基未被污染，用空白培养基作对照。 ②证明选择培养基的选择作用：用牛肉膏蛋白胨培养基接种等量同种菌液作对照。 六、自测

1．选择培养基筛选出的微生物只有一种（

）

2．筛选分解尿素的细菌的培养基上不需要添加尿素（

）

3．只要培养基中有尿素就可以筛选出分解尿素的细菌（

）

4．

稀释涂布平板法既可用于统计活菌数也可用于统计样品中死菌数（

）

5．统计菌落数目也可以用平板划线法（

）

七、达标检测

1．对细菌群体生长规律测定的正确的表述是（

）

A．在液体培养基上进行

B．至少接种一种细菌

C．接种一个细菌

D．及时补充消耗的营养物质

2．使用选择培养基的目的是（

）

A．培养细菌

B．培养真菌

C．使需要的微生物大量繁殖

D．表现某微生物的特定性状与其他微生物加以区别

3．能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是(

) A．CO2和N2

B．葡萄糖和NH3

C．CO2和尿素

D．葡萄糖和尿素

突出呼应、本节回答。

重点。

4．下列说法不正确的是（

）

A．科学家从70－80度热泉中分离到耐高温的TaqDNA聚合酶

B．统计某一稀释度的5个平为该样品菌落数的估计值

C．设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度

D．同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，种类最多

5．为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中加入（

）

A．较多的氮源物质

B．较多的碳源物质

C．青霉素类药物

D．高浓度食盐

答案：ACDBC 板的菌落数依次为M1、M2、M3、M4、M5，以M3作