课题2　多聚酶链式反应扩增DNA片段名师教学设计2

课题2

多聚酶链式反应扩增DNA片段

一、课题目标

1.知识目标

理解PCR的原理和反应过程。

2.能力目标

尝试PCR技术的基本操作。

3.情感目标

通过讨论PCR技术的应用，体会科学技术在生活中的实际运用。

二、课题重点

PCR的原理和基本操作。

三、课题难点

PCR的原理。

四、教学流程

教学流程

环

节

一

：

课

程

导

入

教师活动

展示课题背景，导入课题目标。

课题背景

在刑事侦破案件中常需要对样品DNA进行分析，PCR技术能快速扩增DNA片段，在几个小时内复制出上百万份的DNA拷贝，有效地解决了因为样品中DNA含量太低而难以对样品进行分析研究的问题。现在PCR技术已广泛应用于遗传病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆和基因测序。

课题目标

1.理解PCR的原理和反应过程；

2.尝试PCR技术的基本操作；

学生活动

设计意图

阅读

倾听。

情

景

导

入

本

节

目标。

3.讨论PCR技术的应用。

环

节二：讲

授

新

课

一、基础知识

(一）PCR原理

1.胞内DNA复制的基本体系

引导学生回忆DNA复制相关知识，完成以下表格。

参与组分

解旋酶

DNA母链

4种脱氧核苷酸

DNA聚合酶

催化合成DNA子链

在DNA复制中的作用

打开DNA双链

提供DNA复制的模板

合成子链的原料

回忆、

回答.

理解PCR的原理和反应过程。

引物

使DNA聚合酶能够从引物的3´端开始连接脱氧核

苷酸

2.DNA双链方向与复制关系

引导学生观察教材图5-6 DNA复制方向的示意图，讲解DNA的3´端和5´端，DNA聚合酶的特性以及DNA复制方向。

观察、思考、回答。

（1）DNA的羟基“－OH”末端称为3’端，而磷酸基团的末端称为5’端。

（2）DNA聚合酶只能从3 ´端延伸DNA链，故DNA复制需要引物。

（3）DNA合成总是从子链的5 ´端向3 ´端伸。

3.PCR原理

联系DNA复制相关知识，讲解

PCR原理，并且与细胞内DNA复制比较。

（1）DNA的热变性原理

通过控制温度来控制双链的解聚与结合。

倾听、思

①变性：80－100°C的温度范围内，

DNA双螺旋结构解体，双链分开

②复性：

温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA链重新结合成双链

（2）耐高温的Taq DNA聚合酶

（3）缓冲液为PCR反应提供的物质

DNA模板，分别与两条模板链相结合的两种引物，四种脱氧核苷酸，耐热的DNA聚合酶，同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行。

【方法点拨】细胞内复制和PCR不同点

考、回答，

①

PCR过程需要的引物不是RNA，而是人工合成的DNA单链，观察、思其长度通常为20－30个脱氧核苷酸

②

PCR过程中DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的

（二）PCR的反应过程

引导学生观察教材图5-9 PCR过程图解，理解PCR过程，加以点拨，共同归纳总结。

PCR一般要经历三十多次循环，每次循环分为变性、复性和延伸三步。

(1)变性

温度上升到90 ℃以上时，双链DNA解旋为单链。

考、回答。

(2)复性

温度下降到50 ℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。

(3)延伸

温度上升到72 ℃左右，溶液中的四种脱氧核苷酸(A、T、C、G)

在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。

【方法点拨】

(1)72 ℃左右时，TaqDNA聚合酶有最大活性，可使DNA新链由5′端向3′端延伸。

(2)DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列，使该段固定长度的序列呈“指数式”扩增。

【典型例题】

标准的PCR过程一般分为变性、复性、延伸三大步，这三大步需要的温度依次是(

) A．92 ℃、50 ℃、72 ℃

B．72 ℃、50 ℃、92 ℃

C．50 ℃、92 ℃、72 ℃

D．80 ℃、50 ℃、72 ℃

演练、回答。

倾听、思考、回答。

【答案】A 【方法点拨】

1.变性：温度上升到90 ℃(90～96 ℃)以上时，双链DNA解旋为单链

2.复性：温度下降到50 ℃(40～60 ℃)左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合

3.延伸：溶液中的四种脱氧核苷酸(A、T、C、G)在Taq DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链

二、实验操作

（一）设备及用具

结合实际图解讲解实验操作设备及用具的相关用途。

1.PCR仪

一台能够自动调控温度的仪器

2.微量离心管

一种薄壁塑料管，总容积为0.5ml 3.微量移液器

用于定量转移PCR配方中的液体，其上的一次性吸液枪头用一次更换一次

（二）实验操作步骤

讲解实验操作步骤以及注意事项。

1.准备

按照PCR反应体系的配方将所需用的试剂摆放在实验桌上。

2.移液

用微量移液器按照PCR反应体系配方往微量离心管里面加入各种试剂。

3.混合

①过程：盖严微量离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁。

②注意:

尝试PCR技术的基本操作。

A.离心管口的盖子一定盖严，防止实验中脱落或液体外溢。

B.手指轻轻弹击微量离心管的管壁，目的是使反应液混合均匀。

4.离心

①过程：将微量离心管放在离心机上,离心约10s。

②目的：使反应液体集中在离心管底部，提高反应效果。

5.反应

将离心管放入PCR仪上，设置好PCR仪的循环程序。

循环数

第一次

变性

94°C，10min 复性

－

延伸

－

演练

回答。

30次

９4℃，30s 55℃，30s 72℃，1min

最后一次

９4℃，1min 55℃，30s 72℃，1min 【注意事项】

避免外源DNA等因素的污染

①隔离操作区，所用微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用必须进行高压灭菌；

②分装试剂，简化操作程序，使用一次性枪头。

【典型例题】

在PCR实验操作中，下列说法不正确的是(

) A．在微量离心管中添加各种试剂时，只需一个枪头

B．离心管的盖子一定要盖严，防止液体外溢

C．用手轻弹离心管壁的目的是使反应液充分混合

D．离心的目的是使反应液集中在离心管部，提高反应效果

【答案】A 【方法点拨】

1.在微量离心管中添加各种试剂时，每吸取一种试剂后，移液器

上的枪头必须更换，以确保实验的准确性；

2.离心管的盖子一定要盖严，防止实验中脱落或液体外溢；

3.离心10s的目的是使反应液集中在离心管部，提高反应效果。

三、课题成果评价

（一）理论上DNA扩增数目的计算

引导学生根据DNA复制相关知识推导计算公式。

1.一条DNA，复制n次，

DNA为2n

2.a条DNA，复制n次，

DNA为a ×2n

（二）实验中DNA含量的测定

讲解实验中DNA含量测定的原理和过程。

1.原理

可以通过计算DNA含量来评价扩增的效果，DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与DNA的含量有关。

2.过程

①稀释

2uLPCR反应液，加入98uL蒸馏水，即将样品进行50倍稀释。

②对照调零

以蒸馏水作为空白对照，在波长260nm处，将紫外分光光度计的读数调节至零。

③计算

取DNA稀释液100uL至比色杯中，测定260nm处的光吸收值。

④计算

DNA含量（g）＝50 x(260nm的读数）x 稀释倍数

四、

课题延伸

讲解：PCR技术是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。

它具有特异、敏感、产率高、

快速、

简便、重复性好、易自动化等突出特点。

例如：PCR产物每轮循环增加一倍，30轮循环扩增量达230个拷

推导

公式。

理解DNA含量测定的原理和过程。

贝（109拷贝）。

环节三：共同回顾本节要点：

呼应、回答。

突出本节重点。

课堂小结

一、PCR原理

1.变性：温度上升到90 ℃(90～96 ℃)以上时，双链DNA解旋为单链

2.复性：温度下降到50 ℃(40～60 ℃)左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合

3.延伸：溶液中的四种脱氧核苷酸(A、T、C、G)在Taq DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链

二、PCR操作

1.准备

2.移液

3.混合

4.离心

5.反应

环

节四：课堂练习

PCR过程与细胞内的DNA复制过程相比，主要有两点不同，它们是（

）

①PCR过程需要的引物是人工合成的单链DNA或RNA

②PCR过程不需要DNA聚合酶

③PCR过程中DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的

④PCR过程中，DNA不需要解旋，直接以双链DNA为模板进行复制

A．③④

B．①②

C．①③

D．②④

【答案】C 【方法点拨】1.PCR过程需要耐高温的DNA聚合酶

演练、

回答。

突出

重点。

2.PCR过程中，DNA不依靠解旋酶解旋，而是利用高温解旋，然后以单链DNA为模板进行复制

环节五：板书设计

环节六：教师在教学过程中，可以先引导学生回忆必修2的有关DNA

教学反思

复制的知识，在此基础上，学生可加深对于PCR原理的认识。对于PCR反应过程的教学，应以读图识图为主。教材中反应过程图解详细的描绘了参与PCR的各种组成成分；每一轮反应的三个基本步骤—变性、复性、延伸；每一步骤的作用。教师在教学中可以请学生在读图的同时，结合教科书中的文字说明来加深理解。当学生遇到难以理解的地方时，教师要及时给予解答。