课题3　血红蛋白的提取和分离教学设计和教学实录

选修1课时14 血红蛋白的提取和分离

学习目标1．了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。

2．体验提取生物大分子的基本过程和方法。

自主梳理1．蛋白质的分离原理：

根据蛋白质各种特性的差异分离不同种类的蛋白质，如分子的________、所带电荷的________、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等。

2．凝胶色谱法：

(1)概念：也称做________，是根据________分离蛋白质的有效方法。

(2)(3)分离原理：

分离物质[来源学科网ZXXK]

通道

凝胶外部

________ 路程

______ 较长

速度

较快

_____ 相对分子质量较大

相对分子质量较小

3．缓冲溶液：

(1)组成：通常由1〜2种________溶解于水中配制而成。

(2)作用：抵制外界的酸和碱对________的影响而保持其稳定。

4．电泳：

(1)概念：指________在电场的作用下发生________的过程。

(2)原理：电泳利用了待分离样品中各种分子________以及分子本身的________的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。

(3)两种常用方法：________和聚丙烯酰胺凝胶电泳。

5．血红蛋白的提取和分离：

1

(3)________(即样品的加入和洗脱)：________。

(4)纯度鉴定：________________。

6．凝胶色谱操作：

(1)凝胶色谱柱的制作。

①取长40 cm，内径为1.6 cm的玻璃管，________。

②选择适合封堵玻璃管口的________，中间打孔，孔径大小要能够紧密插入0. 5 mL的移液管。③将橡皮塞上部用刀切出锅底状的凹穴，将0. 5 mL的________头部切下5 cm长的一段，插入橡皮塞孔内，插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面。

④将尼龙网覆盖在橡皮塞的凹穴上，再用________将橡皮塞上部包好，插到玻璃管的一端。

⑤在色谱柱下端用________头部作出口部位，连接一细的尼龙管；并用螺旋夹控制尼龙管的打开与关闭，

尼龙管的另一端放入收集器内。

⑥柱顶部的制作，在色谱柱的另一端插入安装了玻璃管的________。

(2)凝胶色谱柱的装填。

①材料：本实验使用的是________。

②方法：凝胶用________充分溶胀后，配成凝胶悬浮液，一次性缓慢倒入色谱柱内。

③注意事项。

a.商品凝胶使用前需直接________________；

b.装填时可________，使凝胶装填均匀；

2

c.不能有气泡存在，防止其________________________________，降低分离效果；

d.不能发生________________的现象。

④检验：如果红色区带均匀一致地移动，说明色谱柱制作成功。

(3)样品的加入与洗脱。

调整缓冲液面：与凝胶面平齐

↓

滴加透析样品：用吸管将(1)mL透析后的样品加到色谱柱的________ ↓

样品渗入凝胶床：打开下端出口

，使________ ↓

洗脱：打开下端出口

，用________洗脱

↓

收集：待________接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5 mL收集一管，连续收集

课堂练习

1．判断正误：凝胶色谱法分离蛋白质时利用了蛋白质相对分子质量大小和形状的不同。

2．判断正误：在凝胶色谱法分离过程中，血红蛋白比相对分子质量较小的杂蛋白移动慢。

3．判断正误：电泳时带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。

4．判断正误：

猪成熟红细胞中缺少细胞器和细胞核，提纯时杂蛋白较少。

5．判断正误：用于透析的薄膜具有选择透过性。

6．判断正误：可通过凝胶色谱法将相对分子质量较大的杂质蛋白除去。

7．判断正误：若红色区带不均匀地移动，说明色谱柱制作成功。

1．凝胶色谱法分离蛋白质的原理依据是

A.根据蛋白质分子与凝胶的亲和力的大小

B.根据蛋白质相对分子质量的大小

C.根据蛋白所带电荷的多少

D.根据蛋白质溶解度的大小

2．利用凝胶色谱法，什么样的蛋白质先洗脱出来

A.相对分子质量大的

C.相对分子质量小的

3．关于电泳的说法不正确的是

A.电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程

B.带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动

B.溶解度髙的

D.所带电荷多的

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C.蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少

D.用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋白质的电泳迁移率完全取决于分子的大小

4．样品的加入和洗脱的操作不正确的是

A.加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到凝胶面的下面

B.加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内

C.等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口

D.用吸管小心地将1 mL透析后的样品加到色谱柱的顶端，不要破坏凝胶面

5．在利用凝胶电泳法分离蛋白质时，一定要加入缓冲溶液，起到的作用是

A.使酶的活性最高

C.维持蛋白质所带电荷

B.使蛋白质的活性最高

D.使蛋白质带上电荷

6．下面是凝胶色谱法分离血红蛋白时样品加入(图I)和洗脱(图Ⅱ)示意图。请据图回答下列问题：

(1)在加样品示意图中，正确的顺序是________。

(2)用吸管加样品时，应注意正确操作，分别是：

①________________________________________________; ②________________________________________________；

③________________________________________________。

(3)等样品_____________________后，加入缓冲溶液。待________接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每________mL收集一管，连续收集。

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【自主梳理】

1．形状和大小

性质和多少

2．(1)分配色谱法 相对分子质量的大小

(2)多孔球体 多糖类化合物贯穿的通道

(3)较短 凝胶内部较慢

3．(1)缓冲剂 (2)溶液pH

4．(1)带电粒子 迁移

(2)带电性质的差异 大小、形状

(3)琼脂糖凝胶电泳

5．(1)去除杂蛋白 低速短时间离心 蒸馏水和甲苯 过滤除去脂溶性沉淀层 有机溶剂(甲苯) 血红蛋白溶液

(2)小分子 大分子 相对分子质量较小 20 mmol/L的磷酸缓冲液中

(3)纯化 凝胶色谱法

(4)SDS——聚丙烯酰胺凝胶电泳

6．(1)①两端磨平 ②橡皮塞 ③移液管 ④尼龙纱 ⑤移液管 ⑥橡皮塞

(2)①交联葡聚糖凝胶 ②蒸馏水 ③放在洗脱液中膨胀 轻轻敲动色谱柱 搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序 洗脱液流干，露出凝胶颗粒

(3)顶端 样品渗人凝胶床内磷酸缓冲液 红色的蛋白质

【预习小测】

1．×2．×3．√4．√5．×6．√7．×【随堂自测】

1．B 2．A 3．C 4．A 5．C

6．(1)④→①→②→③

(2)①不要破坏凝胶表面 ②贴着管壁加样 ③使吸管管口沿着管壁环绕移动

(3)完全进入凝胶层 红色的蛋白质 5 【解析】在装填好的色谱柱中加入样品时，先打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓缓下降到与凝胶面平齐，关闭出口。用吸管小心地将lmL透析后的样品加到色谱柱的顶端，注意加入时要使吸管管口沿管壁环绕移动，贴着管壁加样，以免破坏凝胶面(④)，加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全渗入之后，关闭下端出口(①)，接着采用同样的方法加入緩冲液到适当髙度(②)，连接緩冲溶液洗脱瓶进行洗脱(④)。待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5mL收集一管，连续收集。

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