课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数教案推荐

课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

一、教学目标：

1、知识与技能

利用选择培养基分离细菌，运用相关技术解决生产生活中有关微生物的计数

2、过程与方法

分析研究思路的形成过程，找出共性和差异性

3、情感、态度与价值观

形成无菌不在的概念，养成讲究卫生的习惯

二、教学重点：对土样的选取和选择培养基的配制

三、教学难点：对分解尿素的细菌的计数

四、教学方法：启发式教学（通过多媒体PPT展示课程内容，启发学生自主探索实验内容）

五、教学工具：多媒体课件

★教学过程——目标呈现阶段

（一）引入新课

上节课我们学习了培养基的配置以及接种技术。下面我们来学习如何进行细菌的分离，获得所需要的目的微生物。

（二）进行新课

1、介绍课题背景

尿素是一种重要的氮肥，农作物不能（能，不能）直接吸收利用，而是首先通过土壤中的细菌将尿素分解为氨和二氧化碳，这是因为细菌能合成脲酶。科学家能从热泉中把耐热细菌筛选出来是因为热泉的高温条件淘汰了绝大多数微生物，这样也适用于实验室中微生物的筛选，原理是人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、PH等），同时抑制或阻止其他微生物生长。

生物适应一定环境，环境对生物具有选择作用。所以通过配制选择培养基、控制培养条件等选择目的微生物。

常见的分解尿素的微生物：芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素。

2、【课题目标】

①从土壤中分离出能够分解尿素的细菌

②统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌

目标达成阶段

（一）研究思路

1、筛选菌株（实例： PCR技术）

DNA多聚酶链式反应是一种在体外将少量DNA大量复制(PCR)的技术，此项技术要求使用耐高温（930C）的DNA聚合酶。

原因：因为热泉温度70～800C，淘汰了绝大多数微生物只有Taq细菌被筛选出来。

启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。

【实验室中微生物的筛选原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。要分离一种微生物，必须根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等】

方法：（1）抑制大多数微生物的生长 （2）促进目的菌株的生长

结果：培养一定时间后，该菌数量上升，再通过平板稀释等方法对它进行纯化培养分离。

★土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：

★培养基选择分解尿素的微生物的原理：

培养基的氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。

〖思考1〗在该培养基配方中，为微生物的生长提供碳源的是葡萄糖

，提供氮源的的是尿素

，琼脂的作用是凝固剂

。

〖思考2〗该培养基对微生物具有（具有，不具有）选择作用。如果具有，其选择机制是只有能够以尿素作为氮源的微生物才能在该培养基上生长

。

2、统计菌落数目

①显微镜直接计数：利用血球计数板(血细胞计数板），在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。

缺点：不能区分死菌与活菌；

不适于对运动细菌的计数；

需要相对高的细菌浓度；

个体小的细菌在显微镜下难以观察。

②间接计数法（活菌计数法）

⑴原理：在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的，即一个菌落代表原先的一个单细胞。

每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M 其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表稀释倍数。

⑵常用方法：稀释涂布平板法。（结合课本介绍稀释涂布平板法的操作步骤及要点）

★注意事项

①为了保证结果准确，一般选择菌落数在30——300的平板上进行计数。

②为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或三个以上的平板中，经涂布，培养计算出菌落平均数。

③统计的菌落往往比活菌的实际数目低。

3、设置对照

★说明设置重复组的重要性

主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。

在设计实验时，一定要涂布至少3个平板，作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性。在分析实验结果时，一定要考虑所设置的重复组的结果是否一致，结果不一致，意味着操作有误，需要重新实验。

6【实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数目的实验时，A同学从对应的10倍稀释的培养基中筛选出大约150个菌落，但是其他同学在同样的稀释度下只选择出大约50个菌落。分析其原因】

原因：⑴土样不同；⑵培养基污染或操作失误(或者是混入了其他的含氮物质) 方案一：由其他同学用与A同学相同土样进行实验 结果预测：如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。

方案二：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。

小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。

4、结果分析与评价

通过对照实验，若培养物有杂菌污染，菌落数偏高；若培养物混入其他氮源，则菌落形态多样，菌落数偏高，难以选择出分解尿素的微生物。

提示：选择每个平板上长有30—300个菌落的稀释倍计算每克样品的菌数最合适。同一稀释倍数的三个重复的菌落数不能相差悬殊，如相差较大，表示实验不精确。

（二）实验设计

1、土壤取样

从肥沃、酸碱度接近中性的湿润土壤中取样。先铲去表层土3 cm左右，再取样，将样品装入事先准

备好的信封中。

◆取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。

2、制备培养基

37由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此选择了一个较为宽泛的范围：稀释倍数为10～10。

准备牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基。每个稀释度下需要3个选择培养基，1个牛肉膏蛋白胨培养基。还需要8个灭菌试管和1个灭菌移液管

。

将稀释相同倍数的菌液，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，因此，牛肉膏蛋白胨培养基可以作为对照，用来判断选择培养基是否起到了选择作用。

3、稀释样品

◆分离不同的微生物采用不同的稀释度

原因：不同微生物在土壤中含量不同

目的：保证获得菌落数在30～300之间、适于计数的平板

◆应在火焰旁称取土壤10g。

◆在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行

问题：为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？

原因：土壤中各类微生物的数量（单位：株/kg）是不同的。例如在干旱土壤中的上层样本中：好氧及兼性厌氧细菌数约为2 185万，放线菌数约为477万，霉菌数约为23.1万。

结论：为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。

4、取样涂布

◆实验时要对培养皿作好标记。注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。

◆如果得到了2个或2个以上菌落数目在30——300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确，需要重新实验。

5、微生物的培养和观察

◆培养不同微生物往往需要不同培养温度。

细菌：30～37℃培养1～2d 放线菌：25～28℃培养5～7d 霉菌：25～28℃的温度下培养3～4d。

◆在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。

选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。 【操作提示】

①无菌操作

A、取土用的小铁铲的盛土样的信封在使用前都需要灭菌。

B、应在火焰旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入锥形瓶中，塞好棉塞。

C、在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。

②做好标记

注明培养基种类、培养日期、平板培养样品的稀释度等。

③规划时间

（三）本课题知识小结

目标检测阶段

【例题讲解】

例1．对细菌群体生长规律测定的正确的表述是（ ）

A．在液体培养基上进行 B．至少接种一种细菌 C．接种一个细菌 D．及时补充消耗的营养物质

解析：细菌群体生长规律的测定是人们在一定条件下进行的。这些条件是：一种细菌、恒定容积的培养基，液体培养基、定时测定细菌总数。在这些条件下，才能测定出细菌的生长规律。测定时只能用一种细菌的子细胞群体的变化规律表达微生物的生长；恒定容积是给微生物提供一定的生存环境；液体培养基才能通过样品推测细菌总数。若接种多种细菌，则会发生种间斗争而不能测定一种微生物的生长规律。在接种时，要保证一定的接种量。

答案：A 例2．在微生物群体生长规律的测定中，种内斗争最显著最激烈的时期是（ ）

A．调整期 B．对数期 C．稳定期 D．衰亡期

解析：种内斗争是一种生态因素。种内斗争反应了种内生物对生存空间和生活资源的争夺。在生活空间充裕，营养充足的时候，种内斗争的程度是比较低的。随着微生物个体数目的增加，每个个体的生存空间越来越少，营养物质也越来越少，每个个体对生存空间和资源的争夺也越来越激烈，种内斗争就越来越激烈。由此可知，在稳定期的种内斗争最激烈。在衰亡期，微生物的数目已经开始减少，pH已经极度不适于微生物的生存，次级代谢产物积累到很高的程度，这时的微生物的生存斗争主要是与无机环境的斗争。

答案：C 【家庭作业】通过完成练习册上相关训练习题，巩固课堂知识内容