课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数教学实录

2.2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

一、学习目标

1、简述尿素在生产实践中的作用及分解尿素的细菌的作用。

2、研究培养基对微生物的选择作用。

3、进行土壤中分解尿素细菌的分离与计数。

4、简述活菌计数技术的应用。

二、重点难点

1、课题重点：对土样的选取和选择培养基的配制

2、课题难点: 对分解尿素的细菌的计数

三、考情分析

1、考纲要求：

2、题型与分值：非选择题（0-15分）

四、课前预习案

阅读教材P23 “实验设计”，能够整理归纳出实验设计包括的内容，

1、实验流程

2、实验设计

包括的内容有： 、 、 和 ，具体的实验步骤以及时间安排等的综合考虑和安排。

实验设计原则：设计重复组（3个）

设计 。

3、实验步骤

（1）土壤取样：土壤有 之称，土壤中微生物 ，在 表层，有更多的微生物生长，土壤

中的微生物大约 是细菌，细菌适宜生活在 取样：从肥沃、湿润的土壤中，用无菌小铁铲铲去表层土取距地表约 的土壤层，迅速取土壤并装入____________密封

（2）样品稀释

稀释原因：样品稀释程度直接影响 ，

稀释标准：选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得菌落数在 ，适于计数的平板

稀释倍数：测定细菌：选用稀释 倍

，测定放线菌：选用稀释 倍 测定真菌：选用稀释 倍

（3）微生物的培养与观察

培养：不同种类的微生物，往往需要不同的培养 和培养 。[来源:Z*xx*k.Com]

细菌： 放线菌： 真菌： 观察：在实验过程中，一般每隔 统计一次 数目，选取菌落数目 的记录作为结果，这样可以 。

菌落特征： （4）细菌的计数[来源:Z|xx|k.Com]

当菌落数目稳定时，选取菌落数在

的平板进行计数。在

下，至少对

个平板进行重复计数，然后求出

，并根据平板所对应的稀释度计算判断正误

1、选择培养基筛选出的微生物只有一种（ ）

2、筛选分解尿素的细菌的培养基上不需要添加尿素（ ）

3、只要培养基中有尿素就可以筛选出分解尿素的细菌（ ）

出样品中细菌的数目。

4、稀释涂布平板法既可用于统计活菌数也可用于统计样品中死菌数（ ）

5、统计菌落数目也可以用平板划线法（ ）

五、教学过程：

（一）课题背景

1、尿素的利用：尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。

2、细菌能利用尿素的原因：土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶

3、常见的分解尿素的微生物：芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素。

4、课题目的

①从土壤中分离出能够分解尿素的细菌

②统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌

（二）研究思路

1、筛选菌株

（1）实例：

PCR技术：DNA多聚酶链式反应是一种在体外将少量DNA大量复制(PCR)的技术，此项技术要求使用耐高温（930C）的DNA聚合酶。

耐高温的酶存在于哪里？水生耐热细菌Taq中

Taq细菌在哪发现的？美国黄石国家公园的一个热泉中

自然界中目的菌株筛选的依据：根据目的菌株对生存环境的要求，

到相应的环境中去寻找。

为什么Taq细菌能从热泉中被筛选出来呢？原因：因为热泉温度70～800C，淘汰了绝大多数微生物只有Taq细菌生存下来即被筛选出来。而实验室中微生物的筛选也应用了同样的原理。

（2）实验室中微生物的筛选原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。

方法：抑制大多数微生物的生长，促进目的菌株的生长

结果：培养一定时间后，该菌数量上升，再通过平板稀释等方法对它进行纯化培养分离。

（3）土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：

（4）培养基选择分解尿素的微生物的原理

该培养基的配方中尿素是唯一的氮源，只有能够合成脲酶的微生物才能利用尿素，才能在该培养基上生长。其他的微生物由于缺乏脲酶不能分解尿素，从而缺乏氮源不能在培养基上生长繁殖，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。

选择培养基：

在微生物学中，允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。

2、统计菌落数目

（1）显微镜直接计数法：这种方法是利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。

缺点：不能区分死菌与活菌；(台酚蓝正常的活细胞，胞膜结构

完整，能够排斥台盼蓝，使之不能够进入胞内；而丧失活性或细胞膜不完整的细胞，胞膜的通透性增加，可被台盼蓝染成蓝色。) 不适于对运动细菌的计数；

需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察；

（2）间接计数法(活菌计数法)：

常用方法：稀释涂布平板法。

原理：在稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。（1个菌落→1个活菌）

注意事项：

①为了保证结果准确，一般选择菌落数在30——300的平板上进行计数。

②为使结果接近真实值每个稀释度取3个平板，经涂布，培养计算出菌落平均数。

③统计的菌落往往比活菌的实际数目低。这是因为两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此，统计结果一般用菌落数而不是活菌数来表示。

3、设置对照

对照实验是指除了被测试条件以外，其他条件都相同的实验，其作用是比照实验组，排除任何其他可能原因的干扰，证明确实是所测试和条件引起相应的结果。设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。

（三）实验设计：

1、实验设计的内容包括

,

实验方案、所需仪器、材料、用具和药品、具体的实施步骤以及时间的安排

2、观察图示2－7理解后思考实验流程。

实验流程：配制土壤溶液，制备培养基，系列稀释，涂布平板与培养，菌落计数

3、土壤有“微生物的天然培养基”之称。土壤微生物主要分布在地表3-8CM的近中性的潮湿土壤中，约70％～90％为细菌。

A、土壤取样

（1）取样的位置：

土壤，微生物的天然培养基，含有大量的微生物，其中70∼90％是细菌。细菌适宜在酸碱度接近中性的潮湿土壤中生长，在富含有机质的土壤层的3∼8cm处中分布着绝大多数的细菌。

（2）取样要求：先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。

◆应在火焰旁称取土壤10g。

◆取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。

B、制备培养基：准备牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基将菌液稀释相同的倍数，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，因此，牛肉膏蛋白胨培养基可以作为对照，用来判断选择培养基是否起到了选择作用。

C、样品的稀释

◆应在火焰旁称取土壤10g。将称好的土样倒入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，塞好棉塞。依次等比稀释至106稀释度

◆在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行。

思考题：为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？

这是因为土壤中各类微生物的数量（单位：株/kg）是不同的，例如在干旱土壤中的上层样本中：好氧及兼性厌氧细菌数约为2 185万，放线菌数约为477万，霉菌数约为23.1万。因此，为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。

D、取样涂布

选取适合的稀释范围分别吸取0.1 mL进行平板涂布操作。如果得到了2个或2个以上菌落数目在30——300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确，需要重新实验。

E、微生物的培养与观察

培养不同微生物往往需要不同培养温度。

细菌：30～37℃培养1～2d

放线菌：25～28℃培养5～7d 在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。

选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。

霉菌：25～28℃的温度下培养3～4d。

将涂布好的培养皿放在30 ℃温度下培养。随着培养时间的延长，会有不同的菌落产生。

比较牛肉膏培养基和选择培养基中菌落的数量、形态等，并做好记录。

（四）结果分析与评价

1.通过对照实验，若培养物有杂菌污染，菌落数偏高；若培养物混入其他氮源，则菌落形态多样，菌落数偏高，难以选择出分解尿素的微生物。

2.提示：选择每个平板上长有30—300个菌落的稀释倍数计算每克样品的菌数最合适。同一稀释倍数的三个重复的菌落数不能相差悬殊，如相差较大，表示实验不精确。

（五）课外延伸

在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。