课题3　血红蛋白的提取和分离优质课教案

公主岭实验中学课堂导学提纲（理） 编号：SWTG-选修1-5.3 使用时间： 编制：

孙立伟

在一定的pH下进行的，例如：血浆的pH是

，要在实验条件下准确模拟生物体内的过程，必须保持体外的pH与体内的基本一致。

思考：说出人体血液中缓冲对？

思考：在血红蛋白整个实验室中用的缓冲液是什么？它的目的是什么？

实验操作

蛋白质的提取和分离一般分为四步：

、

、

和

。

思考：是否所有种类的蛋白质的提取和分离都是这样的？为什么？

（一）样品处理及粗分离

血液由

和

组成，其中红细胞最多。红细胞中有一种非常重要的蛋白质

，其作用是

，血红蛋白有

条肽链组成，包括

，其中每条肽链环绕一个

，此基团可携带

。血红蛋白因含有

呈现红色。

1.

红细胞的洗涤

①目的：去除

②采集的血样要及时采用

（速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的效果），如500r/min离心2min，然后用胶头吸管吸出上层透明的

，将下层

的红细胞液体倒入

再加入

的

（质量分数为0．9％的氯化钠溶液洗涤），缓慢搅拌10min。

③低速短时间离心

④重复2、3步骤

次，直至上清液中已不再呈现

，表明洗涤干净。利于后续血红蛋白的分离纯化，不可洗涤次数过少。

2.

血红蛋白的释放

加

到

体积，再加40％体积的

，置于

上充分搅拌10分钟（加速细胞破裂）, 细胞破裂释放出血红蛋白．

3. 分离血红蛋白溶液

将搅拌好混合液转移到离心管内，以2000r/min的速度离心10 min，试管中的溶液分为4层: 使用的是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模拟细胞内的pH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察（红色）和材料的科学研究（活性）

3．电泳

（1）概念：电泳是指

。

（2）原理：许多重要的生物大分子，如

等都具有

，

在

下，这些基团会带上

。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其

移动。电泳利用了待分离样品中各种分子

以及分子本身

、

的不同使带电分子产生不同的

，从而实现样品中各种分子的分离。

两种常用的电泳方法是

和

，在测定蛋白质分子量时通常使用

。

聚丙烯酰胺凝胶是由

单体丙烯酰胺

和

交联剂N，N’—亚甲基双丙烯酰胺在引发剂和催化剂的作用下聚合交联成的具有三维网状结构的凝胶

。

蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于

等因素。

为了消除静电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加入 。SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条

肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是 。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于 。

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孙立伟

第1层（最上层）：

甲苯层

第2层（中上层）：

的沉淀层，

色薄层固体

第3层（中下层）：

的水溶液层，

的液体

第4层（最下层）：其它杂质

的沉淀层

4．透析

取1mL的血红蛋白溶液装入 中，

将透析袋放入盛有300mL的物质的量的浓度为

20mmol/L的 中，透析12h。透析

可以去除样品中 的杂质，

或用于更换样品的 。如右图：

d、色谱柱下端用移液头部做（

），连接一细的（

），并用螺旋夹控制尼龙管的（

），另一端放入收集（

）的收集器内

③顶塞的制作：

插入安装了玻璃管的橡皮塞

④组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。

⑤安装其他附属结构。

2．凝胶色谱柱填料的处理

（1）凝胶的选择：（

）。

（2）方法：

配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于（

）中充分溶胀后，配成（

）。

（3）凝胶色谱柱的装填方法

①

固定：将色谱柱处置固定在支架上

②装填：将（

）一次性的缓慢倒入（

）内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。

③洗涤平衡：

装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在（

）高的操作压下，用300ml的20mmol/l的磷酸缓冲液（pH为7．0）充分（

）12小时。

3．样品加入与洗脱

（1）加样前：打开下端出口，使柱内凝胶面上的（

）缓慢下降到与

（

）平齐，关闭出口

（2）加透析样品

①调整缓冲液面：与凝胶面平齐

②滴加透析样品：用（

）将1ml（

）的样品加到色谱柱的（

）

③样品渗入凝胶床：（

）

（二）凝胶色谱制作

1．凝胶色谱柱的制作

①取长40厘米，内径1．6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。

②柱底部的制作：

a、首先选择适合的的橡皮塞，中间打孔；

b、在橡皮塞顶部切出锅底状的（

），在0．5ml的（

）头部切下（

）长的一段，插入橡皮塞孔内，上部不得超过橡皮塞的凹穴底面。

c、剪尼龙网小圆片覆盖在（

）上，用（

）的尼龙纱将橡皮塞（

）包好，插到玻璃管一端。

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孙立伟

④洗脱：打开下端，用磷酸缓冲液洗脱

⑤收集：待（

）接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每（

）收集一试管连续收集

思考：与其它真核细胞相比，红细胞有什么特点？这一特点对你进行蛋白质的分离有什么意义？

思考：你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？

血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即样品的处理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即（

）；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量较大杂质蛋白除去，即样品的（

）；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行（

）。

操作提示

见教材69页

实验结果分析与评价

1、你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处理后的样品发生了哪些变化吗？

观察你处理的血液样品离心后是否分层（见教科书图5-18），如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。

2、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱柱装填得成功吗？你是如何判断的？

于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可以加入大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖—2000或红色葡聚糖，观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。 第

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3、你能观察到蛋白质的分离过程中红色区带的移动吗？请描述红色区带的移动情况，并据此判断分离效果？

如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。

思考：如何测定蛋白质的分子量？

使用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量时，可选用一组已知分子量的标准蛋白同时进行电泳，根据已知分子量的标准蛋白的电泳区带位置，用电泳迁移率和分子量的对数作标准曲线，可以测定未知蛋白质的分子量。

二、深入学习

1、加入柠檬酸钠的目的是_________________________。

2、洗涤操作过程中，低速短时间离心的作用：速度越高和时间越长会使其它血细胞等同沉淀达不到分离的效果。

3、使红细胞洗涤干净的方法是：重复洗涤三次，直至上清液中没有 ，表明红细胞已洗涤干净。 4、用质量分数为0.9％的氯化钠溶液洗涤的作用是：维持细胞形态。不能用蒸馏水或浓度高的氯化钠溶液。

5、蒸馏水和甲苯的作用：使红细胞破裂，释放出 。

6、采用 分离血红蛋白。

7、用滤纸过滤，去掉是 。

8、透析袋是一种半透膜，能使小分子自由进出，而大分子（淀粉、蛋白质等）不能通过，留在袋内。

9、透析目的：除去血红蛋白溶液中分子量较小的 。

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