课题2　多聚酶链式反应扩增DNA片段教案及板书设计

生物组5月

公开研究课

多聚酶链式反应扩增DNA片段

教者

于莉姝

一、研究目标

根据学生已有的知识储备，寻找教学最近发展区，引导学生合理利用教材进行学习。

二、课题目标

本课题通过尝试PCR（DNA多聚酶链式反应）技术的基本操作，使学生体验PCR这一常规的分子生物学实验方法，理解PCR的原理，讨论PCR的应用。

三、课题重点与难点

课题重点：PCR的原理和PCR的基本操作。

课题难点：PCR的原理。

四、课题背景分析

课题背景首先介绍了PCR是一种在体外迅速扩增DNA片段的技术，然后说明这一技术在遗传疾病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆等方面都有着广泛的应用，最后指出本课题的目标是了解PCR技术的基本原理，并尝试用PCR技术扩增DNA片段。

五、基础知识分析与教学建议

（一）PCR原理

知识要点：1.细胞内参与DNA复制的各种组成成分与反应条件；2.DNA的合成方向；3.Taq DNA聚合酶的应用。

教学建议：理解PCR的原理，需要首先了解细胞内参与DNA复制的各种组成成分与反应条件。教师在教学过程中，可以首先引导学生回忆必修2《遗传与进化》中的有关DNA复制的知识。在此基础上，学生需要进一步了解DNA双链的方向，芄磺諨NA的3′端和5′端。此外，学生还需要了解DNA聚合酶的特性，如只能从DNA的3′端开始延伸DNA链、而不能从头合成DNA等。

（二）PCR的反应过程[来源:Z,xx,k.Com]

知识要点：PCR的基本步骤及每个步骤所发生的变化。

教学建议：这部分内容的教学应以读图识图为主。教科书中图5-9“PCR反应过程图解”详细地描绘了参与PCR的各组成成分；每一轮反应的三个基本步骤──变性、复性和延伸；每一轮中每一个步骤所发生的变化，即每个步骤所具有的作用。

六、教学设计思路

（一）复习选修3中与PCR技术相关知识，归纳总结：

原理：DNA复制

条件：模板、原料、引物、耐高温DNA聚合酶

PCR技术

过程：变性

复性

延伸

应用：以指数形式扩增，可以在短时间内复制大量的DNA

（二）引导学生预习教材P58~61 相关内容

思考：

①细胞内参与DNA复制的各种组成成分和反应条件

②如何理解DNA分子的两条链的“反向平行”、“ 3ˊ端”

和“ 5ˊ端”

③明确DNA聚合酶的特点和子链DNA合成的方向

（三）引导学生分析教材，指出细胞内DNA复制和PCR技术的异同

教材分析：

第一段：介绍了细胞内参与DNA复制的各种组成成分和反应条件。

第二段：强调DNA分子的两条链是反向平行的，明确DNA分子中的“ 3ˊ端”

和“ 5ˊ端”。解释了DNA合成方向总是从子链的“ 5ˊ端”到“ 3ˊ端”和复制过程需要引物的原因，是由DNA聚合酶特点——不能从头开始合成DNA，只能从“ 3ˊ端”延伸DNA子链。

第三～四段：通过比较指出PCR技术与细胞内DNA复制的不同点：解旋方式不同、DNA聚合酶不同、引物不同。

第五段：归纳了PCR技术进行的条件：①PCR技术反应需要在一定的缓冲溶液中进行②DNA模板③两种引物④四种脱氧核苷酸⑤耐热DNA聚合酶⑥通过控制温度使DNA复制在体外反复进行

（四）结合必修2寻找教学最近发展区

DNA结构

基本单位：脱氧核苷酸的结构（理解“ 3ˊ端”

和“ 5ˊ端”）

双螺旋结构：①反向平行②基本骨架③两条链通过氢键连接（理解热稳定）

场所：细胞核（理解“缓冲液的作用”相当于核液）

DNA复制

条件：①模板②原料③能量④酶（理解PCR技术的反应条件）

过程：（理解子链合成的方向）

七、教学过程

导课

在现代生物技术中，DNA技术可谓是尖端技术。人类基因组计划、基因工程、基因诊断、基因检测、古生物鉴定等都离不开对DNA分子碱基序列的分析。而分析DNA碱基序列，就需要一定量的DNA片段。怎样迅速获得足够量的DNA片段呢？今天我们来研究学习DNA分子的扩增技术――PCR技术。

（一）复习选修3中与PCR技术相关知识，归纳总结：（见教学设计思路）

（二）引导学生预习教材P58~61 相关内容并思考：（见教学设计思路）

（三）引导学生分析教材，指出细胞内DNA复制和PCR技术的异同

1、细胞内参与DNA复制

1.1 DNA的化学组成和分子结构：

1

①脱氧核苷酸的结构

②DNA的合成（3,5-磷酸二酯键）

③DNA的反向平行结构：DNA分子的方向性

1.2 场所：细胞核

1.3 条件：

条件

组分

作用

模板

DNA的两条单链

提供复制的模板

原料

四种脱氧核苷酸

合成DNA子链的原料

酶

解旋酶

打开DNA双螺旋

DNA聚合酶

催化合成DNA子链

能量

ATP 为解螺旋和合成子链供能

引物

RNA 为DNA聚合酶提供合成的3’端起点

1.4 细胞内DNA复制过程

①解旋：解旋酶、ATP，DNA两条链打开，，形成两条DNA单链。

②引物结合：在DNA单链3’端与DNA反向配对结合，确保引物3’端与DNA单链准确配对。

③DNA聚合酶结合：

④子链合成：DNA聚合酶从引物3’端开始，将配对的脱氧核苷酸连接起来。

⑤子链合成特点：不能从头合成；合成方向为“5’→3’合成”。

2.比较指出PCR技术与细胞内DNA复制的不同点：

①解旋方式不同

②DNA聚合酶不同 ③引物不同。

3.PCR技术

3.1 PCR反应进行的条件：

①缓冲液 ②DNA模板 ③两种引物

④四种脱氧核苷酸原料

⑤热稳定DNA聚合酶

⑥PCR仪（通过自动温度周期性调节使DNA复制在体外反复进行）

3.2 PCR反应过程：

①变性：在80～100℃时，DNA双螺旋打开，形成两条DNA单链。

②复性：在50℃左右时，两条DNA单链重新形成双螺旋结构。

③PCR的反应过程

变性

复性

延伸

变性：在95℃时DNA解旋

复性：在50℃时引物与DNA单链结合

延伸：在72℃时合成DNA子链（两个引物间的序列）

（四）实验操作部分（第二课时）

1.实验操作

1.1 PCR反应体系：①缓冲液

②DNA模板

③两种引物

④四种脱氧核苷酸原料

⑤热稳定DNA聚合酶

⑥PCR仪（通过自动温度周期性调节使DNA复制在体外反复进行）

1.2 实验操作步骤

（1）按照PCR反应体系配方配制反应液；

（2）将PCR反应体系50μL用微量移液器转移到微量离心管（0.5mL）中；

（3）将微量离心管放到PCR仪中；

（4）设置PCR仪的工作参数。

（5）DNA在PCR仪中大量扩增。

1.3 水浴法：将微型离心管依次在95℃、55℃、72℃的恒温水浴锅中循环处理相应时间。

3．实验注意事项

3．1避免外源DNA污染：所用仪器、缓冲液、蒸馏水等使用前高压灭菌。

3．2缓冲液和酶分装成小份，－20℃低温保存。

3．3每添加一种反应成分，更换一个移液器的枪头。

3．4混匀后离心处理，使反应液集中在离心管底部。

4．结果分析与评价

4．1反应液稀释：取2µLPCR反应液，添加98µL蒸馏水；2．分光光度计调零：将100µL蒸馏水添加到比色杯中，在260nm处将分光光度计调整读数为零。

4．2将100µL反应稀释液倒入比色杯中，测定在260nm处的光吸收值。

4．3计算：DNA含量＝50×光吸收值×稀释倍数

（五）课堂总结、点评

多聚PCR原理

DNA的复制需要酶、原料、能量、引物

酶DNA的变性和复性受温度影响

链

式反PCR过程

变性

复性

延伸

应

扩增操作步骤

配制PCR反应体系

移入离心管

DNADNA扩增

设置工作参数

放入PCR

片

段

测定含量

稀释

调零

测定并读数

计算

（六）典型例题

见非常学案

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