课题2　多聚酶链式反应扩增DNA片段国家优质课一等奖

《多聚酶链式反应扩增DNA片段》教学设计

开课班级：高二六班 教师：许锦生 时间：2018年5月18日星期五

教学目标

（一）知识与技能

1、了解PCR技术的基本操作

2、理解PCR的原理

3、讨论PCR的应用

（二）过程与方法

在多聚酶链式反应扩增DNA片段的实验过程中，应避免外源DNA污染，严格控制温度等反应条件

（三）情感、态度与价值观

通过对PCR实验的操作及结果分析，培养学生严谨的科学态度和实事求是的科研精神

教学重难点

教学重点：

PCR的原理和PCR的基本操作

教学难点：

PCR的原理

教学工具

多媒体

教学过程

（一）引入新课

在现代生物技术中，DNA技术可谓是尖端技术。人类基因组计划、基因工程、基因诊断、基因检测、古生物鉴定等都离不开对DNA分子碱基序列的分析。而分析DNA碱基序列，就需要一定量的DNA片段。怎样迅速获得足够量的DNA片段呢？今天我们来研究学习DNA分子的扩增技术――PCR技术。

（二）进行新课

1．基础知识

PCR技术扩增DNA的过程，与细胞内DNA复制过程类似：

1．1细胞内DNA复制条件分析：

1．2细胞内DNA复制过程

（1）DNA的反向平行结构：（结合投影图）

核苷酸分子的结构与方向性：（分子结构模式图）

由核苷酸通过3,5-磷酸二酯键连接形成核苷酸长链：（模式图，体现方向性）。

DNA双螺旋结构的反向平行结构：

（2）DNA的复制过程: 解 旋：解旋酶、ATP，DNA两条链打开，形成两条DNA单链。

引物结合：在DNA单链3’端与DNA反向配对结合，确保引物3’端与DNA单链准确配对。

DNA聚合酶结合：

子链合成：DNA聚合酶从引物3’端开始，将配对的脱氧核苷酸连接起来。

后续加工：DNA聚合酶I将引物切去，并合成空缺处的DNA单链，再由DNA连接酶将不连续的DNA子链连接起来（半不连续合成。先导链，滞后链）

子链合成特点：不能从头合成；合成方向为“5’→3’合成”。

感悟生命的神秘：DNA聚合酶不但能够催化磷酸二酯键的形成，还具有校对功能。它在每引入一个核苷酸后都要复查一次，只有碱基配对无误后才能继续往下聚合，它不能从头合成。RNA聚合酶没有校对功能，因此RNA的合成不需要引物，而是从头合成的，它的错配可能性较大，在RNA引物完成功能后即被DNA聚合酶I删去，代之以高保真的DNA链。

1．3 DNA分子复制的人工控制

解开螺旋：在80～100℃时，DNA双螺旋打开，形成两条DNA单链，称为变性。

恢复螺旋：在50℃左右时，两条DNA单链重新形成双螺旋结构，称为复性。

复制条件：缓冲液,DNA模板,四种脱氧核苷酸,热稳定DNA聚合酶,两种引物。

反应场所：PCR仪（自动温度周期性调节）。

1．4PCR的反应过程

变性：在95℃时DNA解旋

复性：在50℃时引物与DNA单链结合

延伸：在72℃时合成DNA子链（两个引物间的序列）2．实验操作

2．1 PCR反应体系：缓冲液、DNA模板，四种脱氧核苷酸原料、热稳定DNA聚合酶、两种RNA引物，水

2．2 实验操作步骤

2．3 按照PCR反应体系配方配制反应液；

（2）将PCR反应体系50μL用微量移液器转移到微量离心管（0.5mL）中；

（3）将微量离心管放到PCR仪中；

（4）设置PCR仪的工作参数。

（5）DNA在PCR仪中大量扩增。

3．实验注意事项

3．1避免外源DNA污染：所用仪器、缓冲液、蒸馏水等使用前高压灭菌。

3．2缓冲液和酶分装成小份，－20℃低温保存。

3．3每添加一种反应成分，更换一个移液器的枪头。

3．4混匀后离心处理，使反应液集中在离心管底部。

4．结果分析与评价

4．1反应液稀释：取2uLPCR反应液，添加98uL蒸馏水；2．分光光度计调零：将100uL蒸馏水添加到比色杯中，在260nm处将分光光度计调整读数为零。

4．2将100uL反应稀释液倒入比色杯中，测定在260nm处的光吸收值。

4．3计算：DNA含量＝50×光吸收值×稀释倍数

课后小结

板书：

课后习题

1、PCR技术最突出的优点是（

D

）

A .原理简单

B. 原料易找

C. TaqDNA聚合酶有耐热性

D. 快速、高效、灵活、易于操作

2、DNA检测技术可应用于亲子鉴定、遗传病检测等领域。DNA检测离不开对样品DNA的PCR扩增。不同样品DNA的扩增过程或条件不同的是(A )。

A．

引物

B． DNA聚合酶

C．

四种脱氧核苷酸

D．

预变性的温度

3、做PCR使用的微量离心管、枪头、缓冲液及蒸馏水使用前必须进行的关键步骤是（ C ）

A . 反复洗涤

B .不怕外源DNA污染

C . 高压灭菌

D .在—20 ℃储存