课题3　分解纤维素的微生物的分离教学设计案例

课题三

分解纤维素的微生物的分离

教学案

[ 学习目标

]

1.简述纤维素酶的种类和作用。

2.从土壤中分离分解纤维素的微生物。

3.讨论从土壤中分离出分解纤维素的微生物的应用价值。

[ 重难点

]

1.简述纤维素酶的种类和作用。

2.从土壤中分离分解纤维素的微生物。

[ 教学步骤

] 步骤一

：自主预习

一、纤维素和纤维素酶

1．纤维素

(1)元素组成：C、H、O三种元素。

(2)组成单体：葡萄糖。

(3)种类：除天然纤维素外，还有水溶性的羧甲基纤维素钠、不溶于水的微晶纤维素等。

2．纤维素酶

(1)组成：纤维素酶是一种复合酶，包括C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶三种组分。

(2)作用

C1酶、CX酶葡萄糖苷酶纤维素――――――→纤维二糖――――――→葡萄糖

二、纤维素分解菌的筛选

1．方法

刚果红染色法，常用的方法有两种：一种是先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应；另一种是在倒平板时就加入刚果红。

2．原理

纤维素酶刚果红―→红色复合物――→培养基中会出现以

―纤维素纤维素分解菌为中心

的透明圈，据此筛选

三、实验设计及课题延伸

1．实验设计

土壤取样：选择纤维素丰富的环境

选择培养：通过选择培养来增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样品中分离到所需要的菌株

梯度稀释：目的是使菌体分离

涂布培养：将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上

挑选菌株：挑选产生透明圈的菌落

2．课题延伸

(1)为确定透明圈内的菌落是否是纤维素分解菌，需要进行发酵产纤维素酶的实验，纤维素酶的发酵方法有液体发酵和固体发酵两种。

(2)纤维素酶的测定方法，一般是对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的葡萄糖进行定量的测定。

步骤二

：

合作探究

探究一

：纤维素分解菌的鉴别

一、情景材料：动物和人的细胞都不能合成纤维素酶，因此都不能直接利用纤维素，兔、牛等草食性动物之所以能长期吃草是因为其肠道内有分解纤维素的微生物，这些微生物将纤维素分解之后，草食性动物再吸收。

1．为什么要在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌？

【提示】

由于生物与环境的相互依存关系，在富含纤维素的环境中，纤维素分解菌的含量相对较高

，因此从这种环境中获得目的微生物的概率要高于普通环境。

2．采用什么方法可以将纤维素分解菌筛选出来？

【提示】

刚果红染色法。

二、要点归纳，整合提升

1．选择培养基与鉴别培养基

特殊选择培养基

控制某一条件(如唯一氮源)或加入鉴别培养基

加入某种指示剂或化学药品

成分

目的

用途

某种物质(如青霉素) 抑制其他微生物生长，促进目的微生物的生长

培养，分离出特定微生物

培养酵母菌和霉菌，可在培养基中与微生物的代谢产物或培养基中的成分发生特定反应

鉴别不同的微生物

可用伊红—美蓝培养基鉴定饮用水或乳制品中是否有大肠杆菌(若有，菌落呈深紫色，并带有金属光泽) 举例

加入青霉素，抑制细菌生长；用尿素作唯一氮源的培养基来培养尿素分解菌

2.纤维素分解菌的鉴别——刚果红染色法

(1)原理

纤维素分解菌

↓

纤维素酶刚果红→红色复合物――――→红色消失、出现透明圈

纤维素即：可根据是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。

(2)两种刚果红(CR)染色法的比较

方法一

方法二

培养基经涂布培养长出菌落→覆盖质量浓度为1 mg/mL的10～15 min后CR溶液――――――→倒去CR过程

溶液→加入物质的量浓度为1 15 min后mol/L的NaCl溶液――――→倒掉NaCl溶液→出现透明圈

配制质量浓度为10 mg/mL的CR溶液→灭菌→按照每200 mL培养基加入1 mL的比例加入CR溶液→混匀→倒平板→接种后培养→出现透明圈

先培养微生物，再加入刚果红倒平板时就加入刚果红

进行颜色反应

显示出的颜色反应基本上是操作简便，不存在菌落混杂问优点

纤维素分解菌的作用

题

区别

①由于在纤维素粉、琼脂和土豆汁中都含有淀粉类物质，可以使能够产生淀粉酶的微生物出现假阳性反应

操作繁琐，加入刚果红溶液会缺点

②有些微生物具有降解色素的使菌落之间发生混杂

能力，长时间培养会降解刚果红，从而形成明显的透明圈，这些微生物与纤维素分解菌不易区分

探究二

实验设计

一、情景材料：选择培养是微生物学中最强有力的技术手段之一。主要是指利用不同微生物间生命活动特点的不同，制定环境条件，使仅适应该条件的微生物旺盛生长，从而使其在群落中的数量大大增加，人们能够更容易地从自然界中分离到所需的特定微生物。

1．为什么选择培养能够“浓缩”所需的微生物？

【提示】

在选择培养的条件下，可以使能够适应这种营养条件的微生物迅速繁殖，而不适应这种营养条件的微生物的繁殖被抑制，因此能起到“浓缩”的作用。

2．选择培养的条件可以从哪些方面进行选择？

【提示】

选择条件可根据所需分离的微生物的特点，从物理、化学、生物及综合多个方面进行选择，如温度、pH、紫外线、高压、光照、氧气、营养等。

二、要点归纳，整合提升

1．土壤取样

在富含纤维素、潮湿的土壤中，用无菌小铁铲铲去表层土，迅速铲取土壤并装入无菌信封，密封。

2．选择培养

(1)具体操作

(2)设置对照

将上述操作过程中的选择培养基改为不含纤维素的培养基，如牛肉膏蛋白胨培养基，其余过程均与(1)过程相同。

3．梯度稀释

用1 mL无菌吸管从选择培养基中吸取1 mL培养液注入盛有9 mL无菌水的试管中，吹吸三次，使充分混匀；再用一支1 mL无菌吸管从此试管中吸取1 mL菌液注入另一支盛有9 mL无菌水的试管中。以此类推配制成101、102、103、104、105、106倍的各种稀释液。

4．涂布培养

(1)将鉴别培养基三个平板分别用记号笔写上10、10、10倍的三种稀释度，另取三个不含纤维素的培养基平板，分别用记号笔写上104、105、106倍的三种稀释度；

(2)然后用三支1 mL无菌吸管分别由104、105、106倍的三管稀释液中吸取0.1 mL对号滴入已写好稀释度的平板上，用无菌涂布器在培养基表面轻轻地涂布均匀。

(3)将培养基平板倒置于30～37 ℃温室中培养1～2 d，每隔24 h观察菌落情况。

5．挑选产生透明圈的菌落

产生透明圈的菌落，一般即为分解纤维素的菌落。

[ 随堂达标

] 1．从土壤中筛选纤维素分解菌的实验设计正确的是(

) A．土壤取样→梯度稀释→稀释涂布平板→发酵培养

B．土壤取样→选择培养→稀释涂布平板→挑选菌落

C．土壤取样→梯度稀释→选择培养→挑选菌落

D．土壤取样→梯度稀释→稀释涂布平板→选择培养→挑选菌落

【解析】

正确的实验设计一般是：土壤取样→选择培养(此步是否需要，应根据样品中的菌株数量的多少来确定)→梯度稀释→将样品涂布到有特定鉴别作用的培养基上→挑选菌落。

【答案】

B 2．纤维素分解菌能够产生纤维素酶分解纤维素。回答下列问题：

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(1)在培养纤维素分解菌的过程中，进行平板划线时，划线结束后仍然要灼烧接种环，原因是___________________________ ___________________________________________________ __________________________________________________。

(2)在筛选纤维素分解菌的过程中，通常用________染色法，这种方法能够通过颜色反应直接对纤维素分解菌进行筛选。甲同学在实验时得到了如图所示的结果，则纤维素分解菌位于(

) A．③

B．①②

C．②③

D．①②③

(3)乙同学打算从牛胃中分离纤维素分解菌并计数，与分离醋酸菌相比，进行培养时除了营养不同外，最主要的实验条件差别是____________，该同学采用活菌计数法统计的菌落数目往往比活菌的实际数目________。

(4)丙同学在提取和分离纤维素酶的过程中，为了抵制外界酸和碱对酶活性的影响，采取的措施是向提取液和分离液中添加____________。若探究纤维素酶活性的最适温度，如何设置对照？_________________________________________________。

【解析】

(1)灼烧接种环最直接的目的是杀死残留微生物，结束后灼烧是为了避免污染环境或感染实验操作者。

(2)刚果红与纤维素形成的红色复合物在纤维素被分解后将不再形成，则在培养基上出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。

(3)牛胃是一个厌氧的环境，所以其中的纤维素分解菌与需氧型醋酸菌培养条件有所不同。因是活菌计数，当菌落重合时，只能计数为一个菌落，所以偏小。

(4)探究最适温度可设置一系列的温度梯度相互对照，其他无关变量要适宜。

【答案】

(1)及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境或感染实验操作者

(2)刚果红

A (3)保证无氧环境

小(低)

(4)缓冲溶液

不同的温度梯度之间相互对照