课题3　血红蛋白的提取和分离优质课教案

专题五

课题3《血红蛋白的提取和分离》教学设计

当阳市第一高级中学 路天梅

【学习目标】

1．尝试对血液中血红蛋白的提取和分离

2．了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的原理

重点：凝胶色谱法的原理和方法

难点：样品的预处理、色谱柱填料的处理和色谱柱的填装

【重点、难点】

【学法指导】

1、

结合教材插图理解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理

2、通过尝试对血液中血红蛋白的提取和分离，体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法

3、教师给出基础题，让学生分组探讨，最后教师归纳总结

【知识连接】

血浆：水、无机盐、血浆蛋白、葡萄糖、氨基酸等物质

1、

血液 红细胞：内含血红蛋白

血细胞 白细胞

血小板

2、

凝胶：由葡聚糖、琼脂糖等多糖类化合物构成的微小的多孔球体，在球体的内部有许多贯穿的通道。

【学习过程】

引入：血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要成分，负责血液中O2和CO2的运输。在本课题中，我们将以血红蛋白为实验材料，学习蛋白质提取和分离的一些基本技术。

知识点一、基础知识

一

一、凝胶色谱法 教材P65页 图5-13

1、概念：凝胶色谱法也称 ，是根据 分离蛋白质的有效方法。

2、原理：

⑴由 构成的凝胶，内部有许多贯穿的 。

⑵当 不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量 的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程 ，移动速度 ；而相对分子质量 的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在 移动，路程 ，移动速度 ，从而使 不同的蛋白质分子得以分离。

二、缓冲溶液

1、作用：在一定范围内，抵制外界的 对溶液PH的影响，维持PH 。

2、配制：由 种缓冲剂溶解于水中配制而成，通过调节缓冲剂的 就可以得到不同PH范围内使用的缓冲液。

二

三、电泳

1

1、概念：指 在电场的作用下发生 的过程。

2、原理：在一定的 下， 、 等生物大分子的可解离集团会带上 。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷 的电极移动。

3、作用：电泳利用了待分离样品中各种分子 的差异及分子本身的 、形状的不同，使带电分子产生不同的 ，从而实现样品中各种分子的分离。

4、方法：常用的电泳方法有 和 。

测定蛋白质分子量时通常使用 。

5、SDS ─

聚丙烯酰胺凝胶电泳

⑴SDS：能断裂蛋白质分子内和分子间的氢键，破坏其空间结构，使蛋白质分解成单条肽链。

⑵作用原理：蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移速率取决于 以及分子的大小等因素。但凝胶中加入SDS，SDS能使蛋白质发生 ，形成单条肽链。SDS与各种蛋白质形成 。由于SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了 ，使电泳的迁移率完全取决于 。

三

知识点二、实验操作

一、蛋白质提取与分离的一般步骤包括 二、具体操作：

红细胞的组成中，约90%是 。血红蛋白由 组成，包括两条 和 。其中每条肽链环绕一个 ，该基团可携带一分子氧和一分子二氧化碳。血红蛋白因含有 而呈现红色。我们以如牛、羊、猪或其它脊椎动物的血液为材料，来分离血红蛋白。

1、样品处理

⑴红细胞的洗涤

①目的是 。

②洗涤过程：

血液 + 柠檬酸钠

→ →

吸出上层血浆

→

红细胞 + → 缓慢搅拌10分钟 → →

吸出上清液

→

反复洗涤三次直到 →

表明红细胞已洗涤干净。

⑵血红蛋白的释放

将洗涤好的红细胞倒入烧杯中，

加 到原血液体积，再加40%体积的甲苯，置于 上充分搅拌10分钟，红细胞破裂释放出 。

四

⑶分离血红蛋白溶液

①过程：将搅拌好的混合液转移到 中，以2000r/min的速度离心10min ②目的：使 和其它杂质分离开来

【想一想】：上述实验操作中甲苯和蒸馏水的作用是什么？

2

③结果：，教材P67页 图5-18 第一层： 层，颜色为无色透明

溶液分 第二层：脂溶性物质沉淀层，颜色为 为4层 第三层： 层，颜色为红色透明液体 第四层：杂质沉淀层，颜色为 ④处理：将试管中的液体用滤纸过滤，除去 ，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的 。

五

2、粗分离

─

透析

⑴原理：透析袋能使 自由进出，而将大分子保留在袋内。

⑵过程：血红蛋白溶液装入透析袋

→

将透析袋放入 中

→

透析12小时

【想一想】：上述操作中，缓冲液的作用是什么？

⑶目的：除去样品中相对分子质量 的杂质。

3、纯化

─

凝胶色谱操作

⑴

凝胶色谱柱的制作（请参照教材P68页 图5-19）

①取长40cm，内径为1.6cm的玻璃管，两端 。

②柱底部制作：

橡皮塞

→

中间 →

橡皮塞上部切出 →

插入移液管头部

→

覆盖 ，再用100目尼龙纱将橡皮塞上部包好

→

插到玻璃管一端

③柱顶部制作：

打孔

→

安装 →

插入橡皮塞

六

⑵

凝胶色谱柱的填装

①固定：将色谱柱垂直固定在支架上

②计算：根据 计算所需凝胶量

③凝胶溶胀：凝胶用 充分溶胀后，配成凝胶悬液

④填装：在色谱柱下端连接的尼龙管 的情况下，将 缓慢倒入色谱柱内，填充时凝胶装填要 ，不能有 存在。

⑤洗涤平衡：装填完后，立即连接 ，并在特定条件下充分 凝胶12小时，使凝胶 。

⑶

样品加入和洗脱

①调整缓冲液面：打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲溶液缓慢下降到与 平齐。

②滴加渗析样品：关闭下端出口，用吸管小心将1ml

样品加到 ，注意不要 ，如图5-22。

③样品渗入凝胶床：加样后打开 ，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭 。

3

④再调整缓冲液面：向色谱柱内小心加入 到适当高度。

⑤洗脱：将色谱柱上端与缓冲液洗脱瓶相连，打开 进行洗脱。

⑥收集：待红色的蛋白质 时，用试管收集流出液，每5 ml一试管，连续收集，如图5-21. 七

4、纯度鉴定（SDS ─

聚丙烯酰胺凝胶电泳）

判断纯化的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质纯度的鉴定。鉴定的方法中使用最多的是 。具体操作请参照知识点一。 知识点三、操作提示

1、红细胞的洗涤：洗涤次数过少，无法除去 ；离心速度过高和时间过 长，会使 等一同沉淀，达不到分离的效果。

2、色谱柱填料的处理：干燥的凝胶使用前需直接放在 中膨胀。 3、凝胶色谱柱的填装：在色谱柱中装填凝胶时要 ，不得有 存在。在凝胶色谱操作过程中，不能发生 ，露出凝胶颗粒的现象。

4、蛋白质的分离：在蛋白质分离过程中，红色区带要 移动。

【归纳小结】

分子越大，移动越快

八

【当堂检测】

1、下列有关凝胶色谱法中样品的加入和洗脱的叙述中，正确的是 ( ) A．先加入1 mL透析后的样品 B．加样前要使缓冲液缓慢下降，全部流出

C．如果红色区带均匀一致地移动，说明色谱柱制作成功

D．洗脱时可以用缓冲液也可以用清水

2、下列有关提取和分离血红蛋白的程度叙述错误的是（

）

A. 样品的处理就是通过一系列操作收集到血红蛋白溶液

B. 通过透析可以去除样品中分子质量较大的杂质，此为样品的粗提取

C. 可通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去，即样品的纯化

D. 可通过SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白的纯度

3、

凝胶色谱法操作正确的是（ ）

A. 将橡皮塞上部用刀切出锅底状的凹穴 B. 将橡皮塞下部切出凹穴

C. 插入的玻璃管的上部要超出橡皮塞的凹穴底面 D. 将尼龙网剪成与橡皮塞下部一样大小的圆片

【课后反思】

多培养学生学会独立思考的能力

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