课题3　血红蛋白的提取和分离国家优质课一等奖

课题3

血红蛋白的提取和分离

一、

基础知识

（课本P64-66）

1.

凝胶色谱法：也称分配色谱法，是根据_______________________分离蛋白质的有效方法。相对分子质量较小的移动速度较慢，而相对分子质量较大的无法__________________，移动速度较快。

2.

缓冲溶液：能够抵制外界的___________对溶液 pH 的影响，维持 pH 基本不变。

3.

电泳：带电粒子在________的作用下发生迁移的过程。

4.

实验操作：

①

样品处理及粗分离：红细胞的洗涤→血红蛋白的释放→分离血红蛋白溶液→透析

②

凝胶色谱柱操作：凝胶色谱柱的制作→_______________→样品的加入和洗脱。

③

纯度鉴定：用 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。

【例1】

用凝胶色谱法分离蛋白质的实验中,相对分子质量不同的两种蛋白质在凝胶中的行进过程,可表示为图中哪一个(

)

【例2】

使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于（ ）

A 电荷的多少 B 分子的大小 C 肽链的多少 D 分子形状的差异

二、

实验操作

目的______________

洗涤次数过少：___________ 离心速度过高时间过长：

____________________

①蒸馏水的作用___________________

②

甲苯的作用_____________________

③充分搅拌的目的是________________

1

离心结果

用磷酸缓冲液处理的目的是什么？

_______________________________

①凝胶装填时尽量______，降低凝胶颗粒间的空隙。

②装填凝胶柱时不得有______,因为_____________________。

①

“加入”的注意事项：_____________________ ②

分离(洗脱)过程中，如何根据红色区带移动情况，判断分离效果? ______________________

【例3】 (2011广东)以下关于猪血红蛋白提纯的描述,不正确的是（ ）

A. 洗涤红细胞时,使用生理盐水可防止红细胞破裂

B. 猪成熟红细胞中缺少细胞器和细胞核,提纯时杂蛋白较少

2

C. 血红蛋白的颜色可用于凝胶色谱法分离过程的

监测

D. 在凝胶色谱法分离过程中,血红蛋白比分子量较小的杂蛋白移动慢

三、课后检测

1. 将经处理破裂后的红细胞混合液以2 000 r/min的速度离心10 min后，离心管中的溶液分为四层，从上到下顺序依次是

A．血红蛋白、甲苯层、其他杂质的暗红色沉淀物、脂溶性物质的沉淀层

B．甲苯层、脂溶性物质的沉淀层、血红蛋白、其他杂质的暗红色沉淀物

C．其他杂质的暗红色沉淀物、血红蛋白、甲苯层、脂溶性物质的沉淀层

D．甲苯层、其他杂质的暗红色沉淀物、血红蛋白、脂溶性物质的沉淀层

2．蛋白质提取过程中有关透析的叙述，错误的是

A．用于透析的薄膜要具有选择透过性

B．透析膜一般是用硝酸纤维素制成的

C．透析能使小分子自由出入，而将大分子保留在袋内

D．透析可用于更换样品的缓冲液

3. 6．在蛋白质的提取和分离中，对于样品的处理过程的分析正确的是

A．洗涤时离心速度过高、时间过长，白细胞等会沉淀，达不到分离的效果

B．洗涤红细胞的目的是除去血浆中的葡萄糖、无机盐

C．洗涤过程中用0.1%的生理盐水

D．透析的目的是去除样品中相对分子质量较大的杂质

4．已知某样品中存在甲、乙、丙、丁、戊五种蛋白质分子，其相对分子质量大小、电荷的性质和数量情况如下图所示，下列有关蛋白质分离的叙述正确的是

A．分子甲与分子乙所带电荷性质不同

B．若用凝胶色谱柱分离样品中的蛋白质，则分子甲移动速度最慢

C．若将样品以2 000 r/min的速度离心10 min，分子丁存在于沉淀中，则分子甲也一定存在于―沉淀中

D．将样品装入透析袋中透析12 h，若分子丙保留在袋内，则分子乙也一定保留在袋内

5．下列是有关血红蛋白的提取与分离的问题，请回答下列问题。

(1)人们用鸡的红细胞提取DNA，用人的红细胞提取血红蛋白，其原因是________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。

(2)凝胶色谱法是根据____________________分离蛋白质的有效方法。所用的凝胶实际

上是一些__________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。

(3)蛋白质的提取和分离实验中，首先要用________________(填写溶液名称)洗涤红细胞，其目的是去除______________。

(4)在________和甲苯的作用下，红细胞破裂，释放出血红蛋白。用________法可分离出血红蛋白。

(5)取血红蛋白溶液装入透析袋，再将透析袋放入pH为7.0的__________中，透析12 h。

6. 红细胞含有大量血红蛋白，红细胞的机能主要是由血红蛋白完成，血红蛋白的主要3

功能是携带O2或CO2，我们可以选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液进行实验，来提取和分离血红蛋白。请回答下列有关问题：

(1)血红蛋白提取和分离的程序可分为四步：________、________、________和________。

(2)实验前取新鲜的血液，要切记在采血容器中预先加入柠檬酸钠，取血回来，马上进行离心，收集血红蛋白溶液。

①加入柠檬酸钠的目的是_____________________________。

②在样品处理中包括红细胞的洗涤、_________________。

③洗涤红细胞的目的是________________，你如何知道红细胞已洗涤干净？______________________________________ ④分离红细胞时对离心速度和离心时间的要求是________________________________。

⑤若离心速度过高和时间过长结果会怎样？_________________________________。

(3)收集的血红蛋白溶液在透析袋中透析，这就是样品的粗分离。

①透析的目的是________________________________________。

②透析的原理是________________________________________________________。

(4)然后通过凝胶色谱法将样品进一步纯化，最后经SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。

①样品纯化的目的是_______________________________________________________。

②血红蛋白有什么特点？___________________________。

这一特点对进行蛋白质的分离有什么意义？_____________________________________。

参考答案：

【例1】B 【例2】B 【例3】D 课后检测：BAAB 5．(1)鸡红细胞具有细胞核，含有DNA，适合用于提取DNA；人红细胞无细胞核，且血红蛋白含量丰富，适合用于提取血红蛋白

(2)相对分子质量的大小

微小的多孔球体

(3)生理盐水

杂蛋白

(4)蒸馏水

离心

(5)(磷酸)缓冲液

解析：(1)鸡的红细胞有细胞核，含DNA丰富；人的红细胞无细胞核，含血红蛋白丰富。(2)凝胶色谱法的凝胶是多孔球体，蛋白质分子小的能通过凝胶颗粒内部而滞留，蛋白质分子大的排阻在外，迅速通过。(3)蛋白质的提取和分离实验中，首先要用生理盐水洗涤红细胞，去除杂蛋白。(4)红细胞吸水涨破后，离心分离出血红蛋白。(5)透析时要将透析袋放入pH为7.0的磷酸缓冲液中。

6.(1)样品处理;粗分离;纯化;纯度鉴定 (2)①防止血液凝固 ②血红蛋白的释放 ③去除杂蛋白; 离心后的上清液没有黄色 ④

低速短时间离心，如500 r/min离心2 min ⑤会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度 (3) ①

去除相对分子量较小的杂质 ②透析袋能使小分子自由进出，而大分子则保留在袋内 (4)①通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂蛋白除去 ②在凝胶色谱分离时可通过观察颜色来直接判断收集洗脱液的时间大大简化了实验操作。

4