课题3　分解纤维素的微生物的分离公开课教案（教学设计）

【目标导航】

1.了解纤维素的组成及筛选纤维素分解菌的方法。2.能进行分离土壤中纤维素分解菌的实验操作。

一、纤维素分解菌的筛选

1．纤维素

(1)组成及特点

纤维素是一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，是地球上含量最丰富的多糖类物质。纤维素能被土壤中某些微生物分解利用，是因为它们能够产生纤维素酶。

(2)分布

棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物。木材、作物秸秆等也富含纤维素。

2．纤维素酶

(1)组成：一种复合酶，它至少包括三种组分，即C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶。

(2)作用

C酶、CX酶葡萄糖苷酶纤维素1――→纤维二糖――→葡萄糖。

3．纤维素分解菌的筛选

(1)筛选方法：刚果红染色法。

(2)筛选原理：刚果红可以与纤维素形成红色复合物，当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红—纤维素的复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，我们可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。

二、分离土壤中纤维素分解菌实验设计

1．分离纤维素分解菌的实验设计

(1)实验流程：土壤取样→选择培养(此步可省略)→梯度稀释→将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上→挑选产生透明圈的菌落。

(2)土壤取样

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采集土样时，可以选择纤维素丰富的环境。

(3)选择培养

①目的：增加纤维素分解菌的浓度，确保能够从样品中分离到所需要的微生物。

②选择培养：称取土样20 g，在无菌条件下加入装有30 mL选择培养基的锥形瓶中，将锥形瓶固定在摇床上，在一定温度下振荡培养1～2 d，直至培养液变混浊。也可重复选择培养。

③挑选菌落

a．刚果红染色法，挑选产生透明圈的菌落，一般即为分解纤维素的菌落。

b．常用的刚果红染色法包括两种，一种是先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应，另一种是在倒平板时就加入刚果红。

2．课题延伸

(1)为确定得到的透明圈中的菌落是纤维素分解菌，需要进行发酵产纤维素酶的实验，纤维素酶的发酵方法有液体发酵和固体发酵两种。

(2)纤维素酶的测定方法

一般是采用对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的葡萄糖进行定量的测定。

判断正误：

(1)纤维素是构成植物细胞壁的主要成分，在纤维素酶的作用下，纤维素可以水解成葡萄糖(

) (2)刚果红可以与纤维素形成透明复合物，所以可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌(

) (3)在筛选能分解纤维素的细菌的实验中，选择培养的目的是增大样品中目的菌株的浓度(

) (4)刚果红染色法只能在培养微生物的时候加入刚果红(

) 答案

(1)√

(2)×

(3)√

(4)×

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一、纤维素酶及两种选择培养基

1．纤维素分解菌的筛选原理

即：可根据是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。

2．筛选过程中涉及的两种培养基

(1)纤维素分解菌的选择培养基

①配方

组分

纤维素粉

NaNO3

Na2HPO4·7H2O KH2PO4

MgSO4·7H2O KCl 酵母膏

水解酪素

含量/g 5 1 1.2 0.9 0.5 0.5 0.5 0.5 生长因子、碳源、氮源

氮源、生长因子

无机盐

提供的主要营养

碳源、能源

将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1 000 mL ②该培养基为液体培养基，利用液体选择培养基可增加纤维素分解菌的浓度。

(2)鉴别纤维素分解菌的培养基

①配方

组分

CMC－Na 酵母膏

含量

5～10 g 1 g 第3页

提供的主要营养

碳源

碳源、氮源、生长因子

KH2PO4

琼脂

土豆汁

0.25 g 15 g 100 mL 无机盐

凝固剂

碳源

将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1 000 mL ②此培养基为固体培养基——在其中加入刚果红可形成以纤维素分解菌为中心的透明圈，据此可筛选到纤维素分解菌。

1．在含有纤维素的培养皿中加入刚果红会出现怎样的现象？再加入纤维素分解菌呢？

答案

刚果红可以与纤维素反应生成红色复合物，再加入纤维素分解菌后，纤维素可以被分解成葡萄糖，所以会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。

2．选择培养和鉴别培养的目的分别是什么？从物理性质的角度看，两种培养基分别是哪种培养基？

答案

选择培养的目的是增大纤维素分解菌在样品中的浓度，鉴别培养的目的是筛选出纤维素分解菌。选择培养的培养基中没有加入琼脂，所以属于液体培养基，而鉴别培养基属于固体培养基。

1．分析下面培养基的配方，请回答下面的问题。

纤维素分解菌的选择培养基：

组分

纤维素粉

NaNO3

Na2HPO4·7H2O KH2PO4

MgSO4·7H2O KCl 酵母膏

水解酪素

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含量

5 g 1 g 1.2 g 0.9 g 0.5 g 0.5 g 0.5 g 0.5 g

将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1 000 mL。

(1)此培养基配方中为微生物提供碳源主要是________________、氮源是________________。

(2)此配方为__________培养基(根据物理状态)配方。

(3)此培养基选择出的微生物主要是______________________________________。

【问题导析】

(1)该培养基中纤维素是主要的碳源，所以可以用于筛选纤维素分解菌。

(2)由于该培养基中没有加入琼脂，所以为液体培养基。液体培养基中微生物与营养成分的接触更充分，可以提高微生物的代谢效率。

答案

(1)纤维素粉

NaNO3、酵母膏、水解酪素

(2)液体

(3)纤维素分解菌

解析

该培养基的主要碳源是纤维素粉，氮源有NaNO3、酵母膏、水解酪素。因没有凝固剂成分，因此，该培养基从物理状态上看属于液体培养基。因该培养基仅以纤维素粉为唯一碳源，因此，可用于选择培养纤维素分解菌。

【一题多变】

(1)从土壤中分离纤维素分解菌时，哪种情况下可以省略选择培养？

答案

当土壤中纤维素分解菌的浓度很高时，可以省略选择培养这一步骤。

(2)本题中的培养基配方中的酵母膏可以为微生物提供什么成分？

答案

可以提供碳源、氮源和生长因子。

(3)该培养基中纤维素是否为唯一的碳源？

答案

不是，纤维素是主要的碳源，另外，酵母膏也可以提供少量的碳源。

二、从土壤中分离纤维素分解菌的实验设计

1．土壤中纤维素分解菌的分离流程

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2．两种刚果红染色法的比较

项目

方法一

培养基长出菌落→覆盖CR溶液10～15 min――→倒去CR溶液→加入过程

配制CR溶液→灭菌→按照1 mL CR/200 mL培养基的比例混匀→倒方法二

15 minNaCl溶液――→倒掉NaCl溶液→平板→培养→出现透明圈

出现透明圈

优点

显示出颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用

操作简便，不存在菌落混杂问题

①由于琼脂、土豆汁中均含有淀粉类物质，可能使产生淀粉酶的微生物也缺点

操作繁琐，加入刚果红会使菌落之间发生混杂

形成透明圈，即假阳性反应；

②有些微生物具有降解色素的能力，它们会降解刚果红形成透明圈，与纤维素分解菌不易区分

1．本实验中采用的接种方法是哪种？并没有对细菌进行计数，为什么还要进行充分的稀释？

答案

接种方法为稀释涂布平板法，充分稀释的目的是尽量使纤维素分解菌与其他杂菌分离，形成单纯由纤维素分解菌形成的菌落。

2．通过实验得到纤维素分解菌后，可以用哪种培养基(选择培养基或鉴别培养基)扩大培养？

答案

可以用选择培养基进行扩大培养，因为选择培养基属于液体培养基，细菌在其中的增殖速度大于在鉴别培养基中的增殖速度。

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2．回答下列有关纤维素分解菌的分离实验的问题：

(1)将流程图补充完整。

①________；②________；③________；④________。

(2)土壤取样：采集土样时，应选择富含________________的环境。

(3)选择培养的方法是称取土样20 g，在无菌条件下加入装有30 mL选择培养基的锥形瓶中，将锥形瓶固定在____________上，在一定温度下振荡培养1～2 d，直至培养液变________。选择培养的目的是__________________________________ _____________________________________________________________________。

(4)为了确定分离到的是纤维素分解菌，还需要进行____________的实验，纤维素酶的发酵方法有________发酵和__________发酵。纤维素酶的测定方法是对纤维素酶分解滤纸等纤维素所产生的____________进行定量测定。

答案

(1)①选择培养

②梯度稀释

③将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上

④挑选产生透明圈的菌落

(2)纤维素

(3)摇床

混浊

增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样品中分离到所需要的微生物

(4)发酵产纤维素酶

液体

固体

葡萄糖

【一题多变】

(1)某同学将滤纸条埋在浅层土壤中，过一段时间从该处的土壤取样用于分离纤维素分解菌，该做法是否合理？为什么？

答案

合理，因为滤纸中富含纤维素，土壤中的纤维素分解菌可以利用纤维素作为碳源大量繁殖。

(2)用射线多次照射筛选出的纤维素分解菌，能否突变产生高效分解纤维素的细菌？如何判断纤维素分解菌的分解效率？

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答案

可能会产生；向纤维素分解菌培养液中加入定量纤维素，定时测定葡萄糖产量的变化。

1．微生物体内能够使纤维素分解成纤维二糖的酶是(

) A．C1酶和CX酶

B．C1酶和葡萄糖苷酶

C．CX酶和葡萄糖苷酶

D．C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶

答案

A 解析

纤维素酶属于复合酶，至少包含C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶三种组分，其中C1酶、CX酶使纤维素分解成纤维二糖。

2．当纤维素被纤维素酶分解后，会在培养基中出现一些透明圈，这些透明圈是

(

) A．刚果红与纤维素形成的复合物

B．纤维素分解后的葡萄糖

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C．由纤维素酶聚集在一起形成的

D．以纤维素分解菌为中心形成的

答案

D 解析

刚果红与纤维素反应形成红色复合物，当有纤维素分解菌生长时，菌落周围的纤维素被分解，形成透明圈。

3．下列有关刚果红染色法的叙述，不正确的是(

) A．刚果红可以在细菌菌落形成前倒平板时加入

B．刚果红可以在菌落形成后加入

C．刚果红在菌落形成前倒平板时加入，加入的刚果红不需要灭菌

D．在菌落形成后加入刚果红时，刚果红不需要灭菌

答案

C 解析

刚果红可以与纤维素形成红色复合物，当纤维素被纤维素酶分解后，红色复合物无法形成，出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，所以可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。刚果红可以在细菌菌落形成前倒平板时加入，也可以在菌落形成后加入。若在细菌菌落形成前倒平板时加入刚果红，则所加刚果红要进行灭菌，以防杂菌的侵入，影响纤维素分解菌菌落的形成；若在菌落形成后加入刚果红，则不需要灭菌。

4．通过分离分解纤维素的微生物实验，对分解纤维素的微生物进行了初步的筛选，这只是分离提纯的第一步，还需要进行(

) A．发酵产纤维素酶的实验

B．提取纤维二糖的实验

C．浓缩纤维素分解菌的实验

D．提取葡萄糖的实验

答案

A 解析

为确定得到的是纤维素分解菌，还需进行发酵产纤维素酶的实验，纤维素酶的测定方法一般是采用对纤维素酶分解滤纸等纤维素后产生的葡萄糖进行定量测定。

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5．下图为分离并统计分解纤维素的微生物的实验流程，据此回答下面有关问题。

挑选产生透将样品接种明圈的菌落，在鉴别纤维土壤取样→梯度稀释→→统计并计算

素分解菌的每克样品中培养基上细菌数(1)要从富含纤维素的环境中分离纤维素分解菌，从高温热泉中寻找耐热菌，这说明___________________________________________________________________。

(2)某同学根据需要，配制了纤维素分解菌的培养基，成分如下，整个实验过程严格执行无菌操作。

组分

纤维素粉

NaNO3

Na2HPO4·7H2O KH2PO4

MgSO4·7H2O KCl 酵母膏、水解酪素

含量/g 5 1 1.2 0.9 0.5 0.5 适量

如果将其中的纤维素粉换成__________________，菌落数____________________，即可说明选择培养基的作用。

(3)本实验宜采用__________________法而不使用平板划线法，原因是该法可以根据稀释体积计算每克样品中的细菌数。

答案

(1)根据目的菌株对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找

(2)葡萄糖

明显多于选择培养基上的菌落数

(3)稀释涂布平板

解析

(1)选择菌种是分离、纯化、扩大培养细菌的前提和基础，其基本原理就是根据菌株对生存环境的要求，到相应环境中去寻找。(2)纤维素分解菌的培养，必须在以纤维素为碳源的培养基上进行。要想说明培养基的作用，需设立对照实验：将纤维素粉换成葡萄糖，进行菌落数比较，可见后者菌落数较多，说明以葡萄糖第10页

为碳源的培养基与以纤维素为碳源的培养基在微生物培养中的作用不同。(3)由题意知，本实验不仅要分离出土壤中的纤维素分解菌，同时还要统计每克土壤样品中的纤维素分解菌的细菌数，因此不能用平板划线法接种，而要用稀释涂布平板法接种。因为前者无法统计出每克样品中细菌数。

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