课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数课堂实录【2】

土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

一、课题背景

1、尿素的利用

尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。

2、细菌利用尿素的原因

土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶，将尿素分解为氨和二氧化碳。

3、常见的分解尿素的微生物

芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素。

4、课题目的

①从土壤中分离出能够分解尿素的细菌；

②统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌。

二.研究思路

㈠.筛选菌株

1、实例：

DNA多聚酶链式反应是一种在体外将少量DNA大量复制的技术，此项技术要求使用耐高温（93C）的DNA聚合酶。 原因：因为热泉温度70～80C，淘汰了绝大多数微生物只有Taq细菌被筛选出来。

启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。

2、实验室中微生物的筛选原理：

人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。

3、选择培养基：在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。

问题：如何证明该选择培养基具有选择作用？

将菌液稀释相同的倍数，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养- 1 -

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基上的数目，因此，牛肉膏蛋白胨培养基可以作为对照，用来判断选择培养基是否起到了选择作用。

㈡.统计菌落数目：

1、显微镜直接计数：

利用血细胞计数板，在显微镜下计数一定容积里样品中微生物的数量。

缺点

不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察；

2.活菌计数法（间接计数法）

（1）常用方法：稀释涂布平板法。

原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。

每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M 统计的菌落数往往比活菌实际数目低

原因：当两个或者多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。

实例分析（P22）：第一同学只涂布了一个平板，没有设置重复组，因此结果不具有说服力。

第二位同学考虑到设置重复组的问题，涂布了三个平板，但是其中1个平板的计数结果与2个相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误，因此，不能简单地将3个平板的计数值用来求平均值。

启示：1、在实验设计时，一定要涂布至少3个平板作为重复组，才能增强实验的说服力和准确性

2、在分析实验结果时，一定要考虑所设置的重复组的结果是否一致，结果不一致，意味着操作有误，需要重新实验。

三、实验设计

1.土壤取样

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从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。

2.制备培养基： 准备牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基。制备以尿素为唯一氮源的选择培养基。

3.样品的稀释 ①应在火焰旁称取土壤10g。

②在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行

③分离不同的微生物采用不同的稀释度 原因：不同微生物在土壤中含量不同

目的：保证获得菌落数在30～300之间、适于计数的平板

4.微生物的涂布

如果得到了3个或3个以上菌落数目在30——300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确，需要重新实验。

5.微生物的培养与观察

培养不同微生物往往需要不同培养温度。

注：在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。

6.结果分析

1.通过对照实验，若培养基有杂菌污染，菌落数偏高；

2.提示：选择每个平板上长有30—300个菌落的稀释倍计算每克样品的菌数最合适。同一稀释倍数的三个重复的菌落数不能相差悬殊，如相差较大，表示实验不精确。

四、操作提示 无菌操作、做好标记、规划时间

五、结果分析与评价 1.培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出菌落 对照的培养基在培养过程中没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。牛肉膏培养基的菌落数目明显大于选择培养基的数目，说明选择培养基已筛选出一些菌落。

2.样品的稀释操作是否成功

如果得到了3个或3个以上菌落数目在30～300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够- 3 -

进行菌落的计数。

3.重复组的结果是否一致

如果学生选取的是同一种土样，统计的结果应该接近。如果结果相差太远，需要进一步分析产生差异的原因。

六.课外延伸

在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。

七、知识小结

八、作业

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