课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数课件配套优秀教案设计

第6课时

土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

一

筛选微生物的研究思路

要把某种微生物和其他的微生物分开，就要利用其代谢特点设计合适的培养基。

1.筛选菌株

(1)实例：DNA多聚酶链式反应(PCR)是一种在体外将少量DNA大量复制的技术，此项技术要求使用耐高温(93 ℃左右)的

。

1966年美国微生物学家布鲁克在美国黄石国家公园的一个热泉中发现了水生耐热细菌Taq，从该细菌中分离得到了耐高温的TaqDNA聚合酶。

(2)原因：因为热泉温度70～80 ℃，淘汰了绝大多数微生物，而使

被筛选出来。

(3)启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。

(4)实验室中微生物的筛选原理：人为提供有利于

生长的条件(包括营养、温度、

等)，同时

或

其他微生物生长。

(5)选择培养基：在微生物学中，将允许

种类的微生物生长，同时

或

其他种类微生物生长的培养基，称做选择培养基。

(6)下面是本课题使用的培养基的配方，请分析：

KH2PO4

Na2HPO4

MgSO4·7H2O 葡萄糖

尿素

琼脂

1.4 g 2.1 g 0.2 g 10.0 g 1.0 g 15.0 g 将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1 000 mL ①从物理性质看此培养基属于

培养基，是由于加入了凝固剂

。

②从功能上看属于

培养基，此培养基的

只有尿素，能利用尿素的微生物可分泌脲酶，因此能在此培养基上生长，此培养基属于

培养基。

2.统计菌落数目

常用来统计样品中活菌数目的方法是

。

(1)统计菌落数目

①稀释：

当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的

。

②计数：一般选择菌落数在

的平板进行计数。

1

③统计：通过统计平板上的

，就能推测出样品中大约含有多少活菌。为使结果接近真实值，可将同一稀释度加到三个或三个以上的平皿中，经涂布，培养计算出菌落平均数。

(2)活菌数的计算方法：每克样品中的菌株数＝

(

÷

)×

。

(3)统计菌落数目：关键是恰当的

。一般以三个稀释度中的第二个稀释度所出现的平均菌落数在50个左右为最好。

(4)统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，这是因为

。因此，统计结果一般用菌落数来表示。

小贴士

显微镜直接计数也是测定微生物数量的常用方法。

1原理：此法利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量，但不能区分细菌的死活。计数板是一块特制的载玻片，上面有一个特定的面积1 mm2和高0.1 mm的计数室，在1 mm2的面积里又被划分成25个或16个中格，每个中格进一步划分成16个或25个小格，计数室由400个小格组成。

2操作：将稀释的样品滴在计数板上，盖上盖玻片，然后在显微镜下计数4～5个中格中的细菌数，并求出每个小格所含细菌的平均数，再按公式求出每毫升样品中所含的细菌数。

3计数公式：每毫升原液所含细菌数＝每小格平均细菌数×400×10 000×稀释倍数。

4缺点：不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察。

3.设置对照

(1)教材中两位同学的统计结果中，第二位同学的结果接近真实值。实验需要改进的操作是第一位同学需

；第二位同学统计的三个菌落数

，说明

，需

。

(2)设置对照的主要目的是排除实验组中

因素对实验结果的影响，提高实验结果的

。设置对照的方法：①空白对照：不给对照组任何处理因素；②条件对照：给对照组施以部分实验因素，但不是所要研究的处理因素；③自身对照：对照组和实验组都在同一研究对象上进行；④相互对照：不单设对照组，而是几个实验组相互对照。

(3)教材提供的案例中A同学的结果与其他同学不同，可能的解释有两种。一是由于土样不同，二是由于培养基污染或操作失误。如何设置对照实验来确定原因？

归纳提炼

1.选择培养基

(1)选择培养基的含义：在培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物的生长，促进需要的微生物的生长。目的是从众多微生物中分离出所需要的微生物。

2

(2)常见的选择培养基

①加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌。

②加入高浓度的食盐可得到金黄色葡萄球菌。

③无氮源培养基可以分离固氮微生物。

④石油是唯一碳源的培养基，可以分离能消除石油污染的微生物。

⑤将培养基放在高温环境中培养，分离耐高温的微生物。

2.用稀释涂布平板法对微生物进行计数时的注意事项

(1)为了保证结果准确，一般设置3～5个平板，选择菌落数在30～300的平板进行计数，并取其平均值。

(2)统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，原因是当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此，统计结果一般用菌落数而不是活菌数来表示。

1.在缺乏氮源的培养基上，大部分微生物无法生长；在培养基中加入青霉素可以抑制细菌和放线菌的生长；在培养基中加入10%的酚可以抑制细菌和霉菌的生长。利用上述选择培养基依次能从混杂的微生物群体中分离出(

) A.乳酸菌、金黄色葡萄球菌、放线菌

B.固氮细菌、大肠杆菌、放线菌

C.固氮细菌、霉菌、放线菌

D.固氮细菌、金黄色葡萄球菌、放线菌

2.用稀释涂布平板法来统计样品中活菌的数目。在某稀释浓度下某同学做了若干个平板并统计每个平板的菌落数，最接近样品中菌体数真实值的是(

) A.菌落数量最多的平板

B.菌落数量最少的平板

C.菌落数量适中的平板

D.取若干个平板菌落数量的平均值

二

实验设计与操作

下面是土壤中尿素分解菌的分离与计数的实验流程示意图，请结合教材提供的资料分析：

1.实验设计和操作提示

步骤

实验操作

操作提示

3

从酸碱度接近

的

土土壤取样

壤中取样。先铲去表层土

左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中

①取样用的小铁铲和盛土样的信封都要经过

；

②土壤中的微生物主要分布在距地表

的近中性土壤中，约

为细菌

牛肉膏蛋白胨培养基可以作为对照，用来判断选择培养基是否起到了

作用

制备培养基

分别配制牛肉膏蛋白胨培养基和尿素为唯一氮源的

培养基

①称取

g土样加到盛有

mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀；

②吸取上清液

mL，转移至盛①应在

旁称取土样；

②由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此选择了一个较为宽样品的稀释和涂布

有

mL的生理盐水的无菌大试管中，按照上图流程进行样品的稀释；

泛的范围

倍的稀释液；

③按照由107～103稀释度的顺序分别吸取

mL进行

操作。按照浓度从

到

的顺序涂布平板，不必更换移液管

将涂布好的培养皿放在

℃温度下培养。随着培养时间的延长，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显

选择培养基上的数目，才说明选择培养基有

作用

①如果得到了

菌落数目符合要求的平板，则说明稀释操当菌落数目

时，选取菌落数在

的平板进行计数。在同作比较成功；

②如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明实验不精确，需要

；

③在菌落计数时，每隔24 h统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目

③实验时要对所用的平板、试管作好标记。如培养皿要注明培养基类型、培养时间、

、培养物等

培养

会有不同的菌落产生。比较牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基中菌落的数量、形态等，并做好记录

计数

一稀释度下，至少对

个平板进行重复计数，然后求出

，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目

2.讨论

(1)为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？

4

①原因：土壤中各类微生物的数量(单位：株/kg)是不同的，因此为获得不同类型的微生物就需要按不同的稀释度进行分离。

②稀释度

微生物

稀释度

细菌

104、105、106

放线菌

103、104、105

真菌

102、103、104

③目的：保证获得菌落数在30～300的平板进行计数。

(2)不同的微生物培养的温度和时间相同吗？

微生物

培养温度

培养天数

细菌

30～37 ℃

1～2 d 放线菌

25～28 ℃

5～7 d 霉菌

25～28 ℃

3～4 d 3.菌落特征：包括菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等。

4.菌种的鉴定

挑选选择培养基中不同形态的菌落接入含

培养基的斜面中，由于细菌合成的

酶分解尿素产生了

，使培养基的碱性增强，pH上升，使指示剂变色，菌落周围变

。

归纳提炼

分离尿素分解菌操作中的注意事项

(1)在实验操作中，每个步骤都要注意无菌操作，以防培养基被污染，影响实验效果。

(2)样品稀释液的最佳浓度为获得每个平板上有30～300个菌落，这个稀释度细菌一般为104、105、106倍液，放线菌一般为103、104、105倍液，真菌一般为102、103、104倍液。

(3)为排除非测试因素(培养基)的干扰，实验需设置空白牛肉膏蛋白胨培养基进行对照。

(4)每一稀释倍数的菌液都至少要涂布3个平板，作为实验重复，求其平均值，若其中有菌落数与其他实验差距悬殊的，需要对该平板重新制作。

3.下列是关于“检测土壤中细菌总数”实验操作的叙述，其中错误的是(

) A.用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基，经高温、高压灭菌后倒平板

B.取104、105、106倍的土壤稀释液和无菌水各0.1 mL，分别涂布于各组平板上

C.将实验组和对照组平板倒置，37 ℃恒温培养24～48小时

D.确定对照组无菌后，选择菌落数在300以上的实验组平板进行计数

4.测定土壤中细菌数量一般选用104、105和106倍的稀释液进行平板培养，而测定真菌的数量一般选用102、103和104倍稀释，其原因是(

) A.细菌个体小，真菌个体大B.细菌易稀释，真菌不易稀释C.细菌在土壤中数量比真菌D.随机的，没有原因

[基础过关]

知识点一

筛选微生物的研究思路

5

1.土壤中分解尿素的微生物所需氮源为(

) A.硝酸

B.氨

C.尿素

D.蛋白胨

2.土壤中的细菌能分解尿素，是因为它们能合成一种(

) A.尿素酶

B.脲酶

C.蛋白酶

D.肽酶

3.产生标准形态菌落的细菌的最初数目和培养基分别是(

) A.一个细菌、液体培养基B.许多细菌、液体培养基C.一个细菌、固体培养基D.许多细菌、固体培养基

4.可以鉴定出分解尿素的细菌的方法是(

) A.以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂B.以尿素为唯一氮源的培养基中加入二苯胺试剂

C.以尿素为唯一氮源的培养基中加入刚果红试剂D.以尿素为唯一氮源的培养基中加入双缩脲试剂

知识点二

实验设计与操作

5.为了从土壤中分离出尿素分解菌，某同学按照下列配方配制培养基。下列叙述中，错误的是(

) 培养基成分

KH2PO4

Na2HPO4

MgSO4·7H2O 葡萄糖

尿素

水

质量

1.4 g 2.1 g 0.2 g 10.0 g 1.0 g 定容到1 000 mL A.该培养基缺少琼脂

B.该培养基中，尿素是唯一的氮源

C.该培养基属于选择培养基

D.需要用刚果红染色法对分离的细菌进行鉴定

6.下列属于菌落特征的是(

) ①菌落的形状

②菌落的大小

③菌落的多少

④隆起程度

⑤颜色

⑥有无荚膜

A.①②③④

B.①②④⑤ C.②③④⑥

D.①②③④⑤⑥

7.给无氮培养基接种土壤稀泥浆的方法是(

) A.打开培养皿盖，取一根接种环沾取少许稀泥浆，轻轻地点接在培养基的表面上

B.取一根接种环在酒精灯的火焰上灭菌后沾取少许稀泥浆，略微打开培养皿盖，在培养基的表面轻点

C.打开培养皿盖，取一根接种环在酒精灯的火焰上灭菌后沾取少许稀泥浆，在培养基的表面轻点

D.略微打开培养皿盖，取一根接种环在酒精灯的火焰上灭菌，冷却后沾取少许稀泥浆，在培养基的表面轻点

8.若某一稀释度下，平板上生长的平均菌落数为80，涂布平板时所用的稀释液体积为0.1 mL，稀释液的稀释倍数为106，则每克样品中的活菌数约为(

) A.8×108

B.8×107

C.8×105

D.8×106

[能力提升]

9.实验测定链霉素对3种细菌的抗生素效应，用3种细菌在事先准备好的琼脂平板上画3条等长的平行线(3条线均与图中的链霉素带接触)，将平板置于37 ℃条件下恒温培养3天，结

6

果如图所示。从实验结果分析，以下叙述不正确的是(

) A.链霉素能阻止结核杆菌的生长

B.链霉素对结核杆菌比对霍乱菌更有效

C.链霉素对结核杆菌比对伤寒菌更有效

D.链霉素可以用于治疗伤寒病人

10.在做分离分解尿素的细菌实验时，A同学从对应106倍稀释培养基上筛选出大约150个菌落，而其他同学只选择出大约50个菌落。A同学的结果产生原因不可能有(

) A.由于土样不同

B.由于培养基污染

C.由于操作失误

D.没有设置对照

11.下列有关微生物培养的叙述，不正确的是(

) A.测定土壤样品中的细菌数目，常用稀释涂布平板法进行菌落计数

B.在对微生物进行培养前，需要对微生物和培养基进行灭菌

C.酵母菌发酵过程产生的酒精，对其他微生物生长有一定的抑制作用

D.分离能分解尿素的细菌，要以尿素作为培养基中唯一的氮源

12.用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数，在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下几种统计结果，正确的是(

) A.涂布了1个平板，统计的菌落数是230 B.涂布了2个平板，统计的菌落数是215和260，取平均值238 C.涂布了3个平板，统计的菌落数分别是21、212和256，取平均值163 D.涂布了3个平板，统计的菌落数分别是210、240和250，取平均值233 13.从自然界微生物中筛选某菌种的一般步骤是：采集菌样→富集培养→纯种分离→性能测定。(1)不同微生物的生存环境不同，获得理想微生物的第一步是从合适的环境采集菌样，然后再按一定的方法分离、纯化。例如，培养噬盐菌的菌样应从

环境中采集。

(2)富集培养指创设仅适合待分离微生物旺盛生长的特定环境条件，使其数量大大增加，从而分离出所需微生物的培养方法。对产耐高温淀粉酶微生物的富集培养应选择

的培养基，并在

条件下培养。

(3)接种前要对培养基进行

处理。在整个微生物的分离和培养中，一定要注意在

条件下进行。

(4)如图是采用纯化微生物培养的两种接种方法接种后培养的效果图，请分析接种的具体方法。

获得图A效果的接种方法是

，获得图B效果的接种方法是

。一同学在纯化土壤中的细菌时，发现培养基上的菌落连成一片，最可能的原因是

，应当怎样操作才可避免此种现象？

。

14.下表为土壤中分解尿素的细菌的分离与计数课题使用的培养基，分析培养基配方，回答下

7

面的问题：

KH2PO4

Na2HPO4

MgSO4·7H2O 葡萄糖

尿素

琼脂

1.4 g 2.1 g 0.2 g 10.0 g 1.0 g 15.0 g

将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1 000 mL

(1)在该培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是

。

(2)按物理性质划分该培养基属于

培养基，理由是培养基中含有

；该类培养基常用于微生物的

等。

(3)由于

，所以该培养基只能用于能够合成

的微生物的培养。用此培养基培养土壤浸出液能够从土壤中筛选出

的细菌。

(4)在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，并能抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称作

。

[个性拓展]

15.根据实验原理和材料用具，设计实验确定细菌质粒的抗菌素基因所抵抗的抗菌素的类别。

实验原理：作为载体的质粒带有标记基因，这一标记基因是抗菌素抗性基因，即有抗性基因的质粒可用作载体。

材料用具：青霉素、四环素各10万单位溶液、菌种试管、灭菌的含细菌培养基的培养皿、酒精灯、接种环、一次性注射器、无菌水、恒温箱。

方法步骤：第一步：分组。

，

用三只注射器分别向3个培养基中注入1 mL无菌水、

、

，并使之均匀分布在整个培养基表面。

第二步：接种。将接种环在

，

接种于三个培养基中。

第三步：培养。将

。

预期结果及结论：

结果

1 有菌落

有菌落

2 有菌落

无菌落

3 无菌落

有菌落

8

结论

质粒上有两种抗性基因

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